חקר מכניקת אנסמבל מיוזין בצרורות נימה של אקטין באמצעות פינצטה אופטית

חקירת התנהגות אקטין באמצעות פרוטוקול זה היא משמעותית מכיוון שהיא מאפשרת למשתמש לחקור את הדינמיקה של אנסמבל החלבון המוטורי באמצעות הדיוק של השמנה אופטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת למדוד מכניקת מיוזין בתוך היררכיה מבנית של אקטין, בניגוד לכיוון החד-מנועי המסורתי של נימה בודדת המשמש בניסויי השמנה אופטיים רבים. יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא אופיו המודולרי, המאפשר למשתמש להתאים אישית את הבדיקה למערכת השלד ההיררכית לפי בחירתם.

כדי להתחיל, להחיל שתי חתיכות של סרט דביק דו צדדי על אמצע מיקרוסקופ להחליק שלושה עד ארבעה מילימטרים זה מזה. לאחר מכן קרעו או חתכו את הסרט העודף שתלוי מקצה השקופית. לאחר מכן, הוסף את הכיסוי המצופה PLL על גבי הקלטת בניצב לציר הארוך של שקופית המיקרוסקופ כדי ליצור ערוץ.

באמצעות צינור קטן כדי לדחוס את הכיסוי להחליק על הקלטת והמיקרוסקופ, להחליק ביסודיות עד שהקלטת היא שקופה, להבטיח כי אין בועות בסרט כמו זה יכול לגרום דליפה מערוץ הזרימה. הוסיפו 15 מיקרוליטרים של הרודמין אקטין המדולל לתא הזרימה PLL ותפתילו את התמיסה העודפת דרך תא הזרימה, אך אל תאפשרו לתעלת הזרימה להתייבש. לאחר מכן, לדגור במשך 10 דקות בתא לחות.

לאחר מכן, הכינו תמיסת קזאין של מיליגרם אחד למיליליטר במאגר פילמור אקטין והוסיפו 15 מיקרוליטרים של התמיסה כדי למנוע קשירה לא ספציפית של הרכיבים הבאים. לאחר מכן, לדגור במשך חמש דקות בתא לחות. לאחר מכן, הוסיפו את הריכוז הרצוי של מיוזין לתרחיף האקטין והחרוזים המוכנים לשימוש ביוטינילי וערבבו בעדינות עם קצה פיפטה.

לאחר מכן, מיד להוסיף 15 microliters של ההשעיה יחד עם ריכוז מיוזין הרצוי לתא הזרימה דגירה במשך 20 דקות. לאחר מכן, אטמו את הקצוות הפתוחים של תא הזרימה עם לק כדי למנוע אידוי במהלך ניסויי הדמיה ולכידה אופטית. לאחר שהמערכת מוכנה, הפעל את הלייזר באמצעות לחצן הפעלת הלייזר בפינה השמאלית התחתונה של המסך ל -50 מילי-וואט ותן לו להתייצב במשך 30 דקות.

לחץ ברצף על כפתורי התאורה, המצלמה, המטרה והתנועה הבימתית בתוך התוכנה כדי להעלות חלונות אלה לצפייה ומניפולציה במהלך הניסוי. הפעל את תאורת המיקרוסקופ על-ידי לחיצה על לחצן הפעלה/כיבוי והגדרתו לעוצמה מרבית על-ידי לחיצה וגרירה של הסרגל כל הדרך ימינה. פתח את אזור הדגימה והסר את מחזיק הדגימה משלב המיקרוסקופ.

לאחר מכן הוסף את תא הזרימה ואבטח אותו באמצעות מחזיקי דגימת המתכת, כדי להבטיח כי החלקת הכיסוי נמצאת בתחתית. לאחר מכן, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של מי RO למרכז המטרה התחתונה והכניסו מחדש את שלב הדגימה. לאחר מכן הרם את המטרה התחתונה באמצעות L2 בשלט הרחוק עד שחרוז המים ייגע במחליק הכיסוי.

לאחר מכן, הורד את המטרה העליונה עד שתגיע לכמחצית המרחק לתא הזרימה באמצעות R2 בשלט הרחוק. לאחר מכן, הוסיפו 170 מיקרוליטרים של מי RO לחלק העליון של תא הזרימה ישירות מתחת למטרה העליונה והורידו את המטרה העליונה עד שהיא שוברת את מתח הפנים של המים ויוצרת מניסקוס. לאחר מכן, הזז את שלב המיקרוסקופ באמצעות כרית החצים בשלט הרחוק עד להגעה לקצה הקלטת הסמוכה לערוץ הזרימה ולאחר מכן סגור את דלת הדגימה.

באמצעות חלון המטרה במסך, הבא את קצה הקלטת ואת המיקוד על-ידי העלאת המטרה התחתונה בשם מטרת לייזר על-ידי לחיצה על החץ העליון והמטרה העליונה על-ידי לחיצה על חץ תחתון באמצעות הפקדים שעל המסך. מצא חרוז צף ולכוד אותו על ידי לחיצה על כפתור תריס המלכודת, אשר יפתח את התריס ויאפשר ללייזר ההשמנה לפגוע בדגימה. לאחר מכן, לחץ על סמן המלכודת על המסך וגרור אותו כדי להזיז את מיקום לייזר ההשמנה.

לאחר ההשמנה, כייל את החרוז על ידי לחיצה על כפתור הכיול. לאחר מכן, לחץ על הגדרות והקלד את קוטר החרוז והטמפרטורה של השלב שנמצא בפינה השמאלית התחתונה של חלון התוכנה. לאחר מכן, לחץ על מלכודת 1, ולאחר מכן על אות X ובצע את התאמת תדר הפינה על ידי לחיצה על הפעלה.

לאחר מכן לחץ וגרור בתוך החלון כדי לייעל את התאמת הפונקציה. לאחר מכן, לחץ על השתמש בו עבור ערכי רגישות ונוקשות ולאחר מכן קבל ערכים. לאחר מכן, סגור את החלון.

מצא צרור אקטומיוזין על-ידי חיפוש חרוזים הקשורים ל-AFs על פני השטח של החלקת הכיסוי ועל-ידי חיפוש שני ה-AFs הפלואורסצנטיים המותאמים לשפות אחרות. הפעל את מקור האור הלבן והשתמש בקוביית הסינון המתאימה כדי לדמות כל נימה של אקטין על ידי סיבוב הצריח. לאחר האימות, לכוד את החרוז המחובר לחוט הלהט העליון של החבילה על ידי לחיצה על כפתור תריס המלכודת.

לאחר מכן, הקלט את הנתונים על ידי לחיצה על כפתור אוסצילוסקופ באמצעות הפקדים שעל המסך. כדי להציג באופן חזותי מדידות מבלי להקליט את הנתונים, לחץ על התחל ולאחר מכן לחץ על שמירה אוטומטית כדי לשמור את כל הנתונים. כדי להקליט מדידות, לחץ על התחל להקליט ובחר אילו נתונים יוצגו באופן חזותי בזמן אמת על ידי בחירה מהתפריט הנפתח X Signal או Y Signal.

עקבות הכוח של מנועי מיוזין שלדיים המייצרים כוח בתוך ההיררכיה המבנית של אקטין במבחנה הבנויה מפגינים רמפה יציבה בכוח עד שמגיעים לרמה של יותר משתיים עד חמש דקות. עם זאת, הוא ציין גם כי כמה צרורות actomyosin שאינם מייצרים כל כוח נטו עקבות הכוח מופיעים כרעש בסיסי או לא מציגים עלייה משמעותית נטו בכוח מעל 90 שניות עקב ריכוז נמוך של מנוע או כיוון מקביל שלילי של החוטים. פיתוח פרוטוקול זה יסלול את הדרך לבניית מבחנים ציטוסקטליים מורכבים יותר במבחנה, שיסייעו עוד יותר במודלים של משימות תאיות בקנה מידה גדול, כגון חלוקת תאים והתכווצות שרירים מלמטה למעלה.