使用光学镊子探测肌动蛋白丝束中的肌球蛋白系综力学

使用该协议研究肌动蛋白行为非常重要，因为它允许用户使用光学捕获的精度来探测运动蛋白集合动力学。该技术的主要优点是能够在肌动蛋白结构层次结构中测量肌球蛋白力学，而不是许多光学捕获实验中使用的传统单电机单丝取向。该协议的另一个优点是其模块化性质，允许用户根据他们选择的分层细胞骨架系统定制测定。

首先，将两片双面胶带贴在显微镜载玻片的中间，彼此相距三到四毫米。然后撕下或切断悬挂在载玻片边缘的多余胶带。接下来，将PLL涂层的盖玻片添加到垂直于显微镜载玻片长轴的胶带顶部，以形成通道。

使用小管将盖玻片压缩到胶带和显微镜上，彻底滑动直到胶带透明，确保胶带中没有气泡，因为这会导致流道泄漏。向PLL流通池中加入15微升稀释的罗丹明肌动蛋白，并通过流通池吸出多余的溶液，但不要让流道变干。然后，在湿度室中孵育10分钟。

接下来，在肌动蛋白聚合缓冲液中制备每毫升1毫克酪蛋白溶液，并加入15微升溶液以防止后续组分的非特异性结合。然后，在湿度室中孵育五分钟。然后，将所需浓度的肌球蛋白添加到制备的生物素化肌动蛋白和珠悬浮液中，并用移液器吸头轻轻搅拌。

然后，立即向流通池中加入15微升悬浮液以及所需的肌球蛋白浓度并孵育20分钟。接下来，用指甲油密封流通池的开口端，以防止在成像和光学捕获实验期间蒸发。系统准备就绪后，使用屏幕左下角的激光电源按钮将激光器打开至 50 毫瓦，并使其稳定 30 分钟。

依次单击软件中的照明、相机、物镜和载物台移动按钮，以调出这些窗口，以便在实验过程中进行查看和操作。通过单击开/关按钮打开显微镜照明，并通过单击并一直向右拖动条将其设置为最大功率。打开样品区域并从显微镜载物台上取下样品架。

然后添加流通池并用金属样品架固定，确保盖玻片位于底部。然后，在底部物镜的中心加入30微升RO水并重新插入样品台。然后使用遥控器上的L2升高下部物镜，直到水珠接触盖玻片。

接下来，使用遥控器上的R2降低顶部物镜，直到达到到流通池距离的一半左右。然后，将170微升RO水添加到流通池顶部的顶部，直接在顶部物镜下方，并降低顶部物镜，直到它破坏水的表面张力并形成弯月面。随后，使用遥控器上的箭头垫移动显微镜载物台，直到到达靠近流道的胶带边缘，然后关闭样品门。

使用屏幕中的物镜窗口，通过单击上方箭头向上显示名为“激光物镜”的底部物镜，并使用屏幕控制单击底部箭头，使顶部物镜上方物镜。找到一个漂浮的珠子并通过单击陷阱快门按钮来捕获它，这将打开快门并允许捕获激光击中样品。然后，单击屏幕上的陷阱光标并拖动它以移动捕获激光的位置。

捕获后，通过单击校准按钮校准磁珠。然后，单击设置并输入软件窗口左下角的珠子直径和载物台温度。接下来，单击陷阱 1，然后单击 X 信号并通过单击运行来执行角频率拟合。

然后在窗口中单击并拖动以优化功能拟合度。然后，单击将其用于灵敏度和刚度值，然后接受值。接下来，关闭窗口。

通过搜索与盖玻片表面上的 AF 结合的磁珠并查找共定位的两个荧光 AF，找到肌动球蛋白束。打开白色光源，并使用适当的滤光片立方体通过转动转塔对每个肌动蛋白丝进行成像。验证后，通过单击陷阱快门按钮捕获附着在束顶部细丝上的珠子。

然后，通过使用屏幕上的控件单击示波器按钮来记录数据。要在不记录数据的情况下可视化测量，请单击“开始”，然后单击“自动保存”以保存所有数据。要记录测量值，请单击“开始记录”，然后通过从下拉菜单中选择“X 信号”或“Y 信号”来选择要实时可视化的数据。

骨骼肌球蛋白马达在构建的体外肌动蛋白结构层次结构内产生力的力迹线表现出稳定的力斜坡，直到在两到五分钟内达到平台期。然而，还观察到一些不产生任何净力的肌动肌肽束，并且力迹线显示为基线噪声，或者由于电机浓度低或灯丝的平行方向不利，在90秒内没有表现出实质性的力净增加。该协议的开发将为构建更复杂的体外细胞骨架测定铺平道路，这将进一步帮助模拟大规模的细胞任务，例如自下而上的细胞分裂和肌肉收缩。