L’étude du comportement de l’actine à l’aide de ce protocole est importante car elle permet à l’utilisateur de sonder la dynamique de l’ensemble des protéines motrices en utilisant la précision du piégeage optique. Le principal avantage de cette technique est la capacité de mesurer la mécanique de la myosine dans la hiérarchie structurelle de l’actine, par opposition à l’orientation traditionnelle à filament unique à moteur utilisée dans de nombreuses expériences de piégeage optique. Un autre avantage de ce protocole est sa nature modulaire, qui permet à l’utilisateur de personnaliser le test au système cytosquelette hiérarchique de son choix.
Pour commencer, appliquez deux morceaux de ruban adhésif double face au milieu d’une lame de microscope à trois à quatre millimètres l’un de l’autre. Ensuite, déchirez ou coupez l’excès de ruban adhésif qui pend du bord de la glissière. Ensuite, ajoutez le couvercle enduit de PLL sur le dessus de la bande perpendiculaire au grand axe de la lame de microscope pour former un canal.
À l’aide d’un petit tube pour comprimer le couvercle sur la bande et le microscope, faites glisser soigneusement jusqu’à ce que la bande soit transparente, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles dans la bande car cela peut provoquer une fuite du canal d’écoulement. Ajouter 15 microlitres d’actine de rhodamine diluée à la cellule d’écoulement PLL et évacuer l’excès de solution à travers la cellule d’écoulement, mais ne laissez pas le canal d’écoulement s’assécher. Ensuite, incuber pendant 10 minutes dans une chambre d’humidité.
Ensuite, préparez une solution de caséine d’un milligramme par millilitre dans un tampon de polymérisation d’actine et ajoutez 15 microlitres de la solution pour éviter la liaison non spécifique des composants suivants. Ensuite, incuber pendant cinq minutes dans une chambre d’humidité. Ensuite, ajoutez la concentration désirée de myosine à la suspension d’actine et de billes biotinylée préparée et remuez doucement avec un embout de pipette.
Ensuite, ajoutez immédiatement 15 microlitres de la suspension avec la concentration de myosine souhaitée dans la cellule d’écoulement et incuber pendant 20 minutes. Ensuite, scellez les extrémités ouvertes de la cellule d’écoulement avec du vernis à ongles pour empêcher l’évaporation pendant les expériences d’imagerie et de piégeage optique. Une fois que le système est prêt, allumez le laser à l’aide du bouton d’alimentation laser situé dans le coin inférieur gauche de l’écran à 50 milliwatts et laissez-le se stabiliser pendant 30 minutes.
Cliquez séquentiellement sur les boutons d’éclairage, de caméra, d’objectif et de mouvement de scène dans le logiciel pour afficher ces fenêtres de visualisation et de manipulation pendant l’expérience. Allumez l’éclairage du microscope en cliquant sur le bouton On/Off et réglez-le à puissance maximale en cliquant et en faisant glisser la barre tout en faisant glisser la barre vers la droite. Ouvrez la zone d’échantillon et retirez le porte-échantillon de l’étage du microscope.
Ajoutez ensuite la cellule d’écoulement et fixez-la avec les porte-échantillons métalliques, en veillant à ce que le couvercle soit sur le fond. Ensuite, ajoutez 30 microlitres d’eau osmosée au centre de l’objectif inférieur et réinsérez l’étape de l’échantillon. Soulevez ensuite l’objectif inférieur à l’aide du L2 de la télécommande jusqu’à ce que le cordon d’eau touche le couvercle.
Ensuite, abaissez l’objectif supérieur jusqu’à ce qu’environ la moitié de la distance jusqu’à la cellule d’écoulement soit atteinte à l’aide du R2 de la télécommande. Ensuite, ajoutez 170 microlitres d’eau osmosée au sommet de la cellule d’écoulement directement sous l’objectif supérieur et abaissez l’objectif supérieur jusqu’à ce qu’il brise la tension superficielle de l’eau et forme un ménisque. Ensuite, déplacez l’étage du microscope à l’aide du pavé fléché de la télécommande jusqu’à ce que le bord de la bande adjacent au canal d’écoulement soit atteint, puis fermez la porte de l’échantillon.
À l’aide de la fenêtre d’objectif à l’écran, amenez le bord de la bande et la mise au point en amenant l’objectif inférieur nommé Objectif laser vers le haut en cliquant sur la flèche supérieure et l’objectif supérieur en cliquant sur la flèche inférieure à l’aide des commandes à l’écran. Trouvez un cordon flottant et piégez-le en cliquant sur le bouton de l’obturateur du piège, ce qui ouvrira l’obturateur et permettra au laser de piégeage de frapper l’échantillon. Ensuite, cliquez sur le curseur de recouvrement à l’écran et faites-le glisser pour déplacer l’emplacement du laser de piégeage.
Une fois piégé, calibrez le cordon en cliquant sur le bouton d’étalonnage. Ensuite, cliquez sur Paramètres et tapez le diamètre de la perle et la température de la scène située en bas à gauche de la fenêtre du logiciel. Ensuite, cliquez sur Trap 1, puis sur X Signal et effectuez l’ajustement de fréquence de coin en cliquant sur Exécuter.
Cliquez ensuite et faites glisser dans la fenêtre pour optimiser l’ajustement de la fonction. Ensuite, cliquez sur Utiliser pour les valeurs de sensibilité et de rigidité, puis acceptez les valeurs. Ensuite, fermez la fenêtre.
Trouvez un faisceau d’actomyosine en recherchant les billes liées aux FA sur la surface du bordereau de couverture et en recherchant les deux AF fluorescents co-localisés. Allumez la source de lumière blanche et utilisez le cube filtrant approprié pour imager chaque filament d’actine en tournant la tourelle. Une fois vérifié, emprisonnez le cordon attaché au filament supérieur du faisceau en cliquant sur le bouton de l’obturateur du piège.
Ensuite, enregistrez les données en cliquant sur le bouton de l’oscilloscope à l’aide des commandes à l’écran. Pour visualiser les mesures sans enregistrer les données, cliquez sur Démarrer, puis sur Enregistrement automatique pour enregistrer toutes les données. Pour enregistrer les mesures, cliquez sur Démarrer l’enregistrement et choisissez les données à visualiser en temps réel en choisissant dans le menu déroulant X Signal ou Y Signal.
La trace de force des moteurs de myosine squelettique générant une force dans la hiérarchie structurelle d’actine in vitro construite présente une montée en force constante jusqu’à ce qu’un plateau soit atteint en deux à cinq minutes. Cependant, on observe également que certains faisceaux d’actomyosine qui ne génèrent aucune force nette et les traces de force apparaissent comme bruit de base ou ne présentent pas d’augmentation nette substantielle de la force sur 90 secondes en raison d’une faible concentration de moteur ou d’une orientation parallèle défavorable des filaments. Ce développement de protocole ouvrira la voie à la construction de tests cytosquelettiques in vitro plus complexes qui aideront davantage à modéliser des tâches cellulaires à grande échelle, telles que la division cellulaire et la contraction musculaire de bas en haut.
