Die Untersuchung des Aktinverhaltens mit diesem Protokoll ist von Bedeutung, da es dem Benutzer ermöglicht, die Dynamik des motorischen Proteinensembles mit der Präzision des optischen Fallens zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, die Myosinmechanik innerhalb der Aktinstrukturhierarchie zu messen, im Gegensatz zu der traditionellen einmotorigen Einzelfilamentorientierung, die in vielen optischen Fallenexperimenten verwendet wird. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist seine modulare Natur, die es dem Benutzer ermöglicht, den Assay an das hierarchische Zytoskelettsystem seiner Wahl anzupassen.
Tragen Sie zunächst zwei Stücke doppelseitiges Klebeband auf die Mitte eines Objektträgers auf, der drei bis vier Millimeter voneinander entfernt ist. Reißen oder schneiden Sie dann das überschüssige Klebeband ab, das am Rand der Folie hängt. Als nächstes fügen Sie den PLL-beschichteten Abdeckstreifen auf dem Band senkrecht zur Längsachse des Objektträgers hinzu, um einen Kanal zu bilden.
Verwenden Sie ein kleines Röhrchen, um den Deckel auf das Band und das Mikroskop zu komprimieren, und schieben Sie gründlich, bis das Band transparent ist, um sicherzustellen, dass keine Blasen im Band vorhanden sind, da dies zu Leckagen aus dem Strömungskanal führen kann. Geben Sie 15 Mikroliter des verdünnten Rhodaminaktins in die PLL-Durchflusszelle und leiten Sie die überschüssige Lösung durch die Durchflusszelle, lassen Sie den Durchflusskanal jedoch nicht trocken werden. Dann 10 Minuten in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren.
Als nächstes wird ein Milligramm pro Milliliter Caseinlösung in Aktinpolymerisationspuffer hergestellt und 15 Mikroliter der Lösung hinzugefügt, um eine unspezifische Bindung der nachfolgenden Komponenten zu verhindern. Dann fünf Minuten in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren. Anschließend die gewünschte Konzentration an Myosin in die vorbereitete biotinylierte Aktin- und Perlensuspension geben und vorsichtig mit einer Pipettenspitze umrühren.
Dann geben Sie sofort 15 Mikroliter der Suspension zusammen mit der gewünschten Myosinkonzentration in die Flusszelle und inkubieren für 20 Minuten. Als nächstes versiegeln Sie die offenen Enden der Durchflusszelle mit Nagellack, um eine Verdunstung während der Bildgebung und der optischen Fangexperimente zu verhindern. Sobald das System fertig ist, schalten Sie den Laser mit dem Laser-Power-Button in der linken unteren Ecke des Bildschirms auf 50 Milliwatt ein und lassen Sie ihn 30 Minuten lang stabilisieren.
Klicken Sie nacheinander auf die Schaltflächen Beleuchtung, Kamera, Objektiv und Bühnenbewegung in der Software, um diese Fenster zur Anzeige und Manipulation während des Experiments aufzurufen. Schalten Sie die Mikroskopbeleuchtung ein, indem Sie auf die Schaltfläche On/Off klicken und sie auf maximale Leistung einstellen, indem Sie klicken und den Balken ganz nach rechts ziehen. Öffnen Sie den Probenbereich und nehmen Sie den Probenhalter vom Mikroskoptisch.
Fügen Sie dann die Durchflusszelle hinzu und sichern Sie sie mit den Metallprobenhaltern, wobei Sie sicherstellen, dass sich der Abdeckschein auf der Unterseite befindet. Anschließend werden 30 Mikroliter RO-Wasser in die Mitte des unteren Objektivs gegeben und der Probentisch wieder eingesetzt. Heben Sie dann das untere Objektiv mit dem L2 auf der Fernbedienung an, bis die Wasserperle den Abdeckschein berührt.
Als nächstes senken Sie das obere Objektiv mit dem R2 auf der Fernbedienung ab, bis etwa die Hälfte der Entfernung zur Durchflusszelle erreicht ist. Fügen Sie dann 170 Mikroliter RO-Wasser in die Oberseite der Durchflusszelle direkt unter dem oberen Objektiv und senken Sie das obere Objektiv ab, bis es die Oberflächenspannung des Wassers bricht und einen Meniskus bildet. Bewegen Sie anschließend den Mikroskoptisch mit dem Pfeilpad auf der Fernbedienung, bis der Rand des Bandes neben dem Strömungskanal erreicht ist, und schließen Sie dann die Probenklappe.
Verwenden Sie das Zielfenster auf dem Bildschirm, um den Rand des Bandes zu lenken und zu fokussieren, indem Sie das untere Objektiv mit dem Namen Laserobjektiv nach oben bringen, indem Sie auf den oberen Pfeil klicken, und das obere Ziel, indem Sie auf den unteren Pfeil klicken. Finden Sie eine schwimmende Perle und fangen Sie sie ein, indem Sie auf den Fallenauslöser klicken, der den Verschluss öffnet und es dem Fanglaser ermöglicht, die Probe zu treffen. Klicken Sie dann auf den Fallencursor auf dem Bildschirm und ziehen Sie ihn, um die Position des Trapping-Lasers zu verschieben.
Kalibrieren Sie die Perle nach dem Einfangen, indem Sie auf die Kalibrierungsschaltfläche klicken. Klicken Sie dann auf Einstellungen und geben Sie den Durchmesser der Perle und die Temperatur der Stufe unten links im Softwarefenster ein. Klicken Sie anschließend auf Trap 1, dann auf X Signal und führen Sie die Eckfrequenzanpassung durch, indem Sie auf Ausführen klicken.
Klicken und ziehen Sie dann innerhalb des Fensters, um die Funktionsanpassung zu optimieren. Klicken Sie anschließend auf Verwenden Sie es für Empfindlichkeits- und Steifigkeitswerte und akzeptieren Sie dann Werte. Schließen Sie anschließend das Fenster.
Finden Sie ein Actomyosin-Bündel, indem Sie nach Perlen suchen, die an AFs auf der Oberfläche des Deckblatts gebunden sind, und indem Sie nach beiden fluoreszierenden AFs suchen, die kolokalisiert sind. Schalten Sie die weiße Lichtquelle ein und verwenden Sie den entsprechenden Filterwürfel, um jedes Aktinfilament abzubilden, indem Sie den Turm drehen. Nach der Überprüfung fangen Sie die Perle ein, die am oberen Filament des Bündels befestigt ist, indem Sie auf den Fallenauslöser klicken.
Zeichnen Sie dann die Daten auf, indem Sie mithilfe der Bildschirmsteuerung auf die Oszilloskopschaltfläche klicken. Um Messungen zu visualisieren, ohne die Daten aufzuzeichnen, klicken Sie auf Start und dann auf Autospeichern, um alle Daten zu speichern. Um Messungen aufzuzeichnen, klicken Sie auf Aufnahme starten und wählen Sie aus dem Dropdown-Menü X-Signal oder Y-Signal aus, welche Daten in Echtzeit visualisiert werden sollen.
Die Kraftspur von skelettalen Myosinmotoren, die Kraft innerhalb der konstruierten in vitro Aktinstrukturhierarchie erzeugen, zeigen eine stetige Rampe in Kraft, bis ein Plateau über zwei bis fünf Minuten erreicht ist. Es wird jedoch auch beobachtet, dass einige Actomyosin-Bündel, die keine Nettokraft erzeugen und die Kraftspuren als Basislinienrauschen erscheinen oder aufgrund einer geringen Motorkonzentration oder einer ungünstigen Parallelorientierung der Filamente keine wesentliche Nettokraftzunahme über 90 Sekunden aufweisen. Diese Protokollentwicklung wird den Weg für die Erstellung komplexerer In-vitro-Zytoskelett-Assays ebnen, die weiter dazu beitragen werden, große zelluläre Aufgaben wie Zellteilung und Muskelkontraktion von unten nach oben zu modellieren.
