Studiare il comportamento dell'actina utilizzando questo protocollo è significativo perché consente all'utente di sondare la dinamica dell'insieme proteico motorio utilizzando la precisione dell'intrappolamento ottico. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di misurare la meccanica della miosina all'interno della gerarchia strutturale delle actine, in contrasto con il tradizionale orientamento a filamento singolo a motore singolo utilizzato in molti esperimenti di intrappolamento ottico. Un altro vantaggio di questo protocollo è la sua natura modulare, che consente all'utente di personalizzare il test al sistema di citoscheletro gerarchico di propria scelta.
Per iniziare, applicare due pezzi di nastro adesivo biadesivo al centro di un vetrino da microscopio a tre o quattro millimetri di distanza l'uno dall'altro. Quindi strappare o tagliare il nastro in eccesso che pende dal bordo della diapositiva. Quindi, aggiungere la linguetta di copertura rivestita in PLL sulla parte superiore del nastro perpendicolare all'asse lungo del vetrino del microscopio per formare un canale.
Utilizzando un piccolo tubo per comprimere la scivolata di copertura sul nastro e sul microscopio, far scorrere accuratamente fino a quando il nastro è trasparente, assicurandosi che non ci siano bolle nel nastro in quanto ciò può causare perdite dal canale di flusso. Aggiungere 15 microlitri di rodamina actina diluita alla cella di flusso PLL e asciugare la soluzione in eccesso attraverso la cella di flusso, ma non lasciare che il canale di flusso si asciughi. Quindi, incubare per 10 minuti in una camera di umidità.
Quindi, preparare una soluzione di caseina da un milligrammo per millilitro in tampone di polimerizzazione dell'actina e aggiungere 15 microlitri della soluzione per evitare il legame non specifico dei componenti successivi. Quindi, incubare per cinque minuti in una camera di umidità. Successivamente, aggiungere la concentrazione desiderata di miosina all'actina biotinilata preparata e alla sospensione di perline e mescolare delicatamente con una punta di pipetta.
Quindi, aggiungere immediatamente 15 microlitri della sospensione insieme alla concentrazione di miosina desiderata alla cella di flusso e incubare per 20 minuti. Quindi, sigillare le estremità aperte della cella di flusso con smalto per unghie per prevenire l'evaporazione durante gli esperimenti di imaging e di intrappolamento ottico. Una volta che il sistema è pronto, accendere il laser utilizzando il pulsante di accensione laser nell'angolo in basso a sinistra dello schermo a 50 milliwatt e lasciarlo stabilizzare per 30 minuti.
Fare clic in sequenza sui pulsanti di illuminazione, fotocamera, obiettivo e movimento scenico all'interno del software per visualizzare quelle finestre per la visualizzazione e la manipolazione durante l'esperimento. Accendere l'illuminazione del microscopio facendo clic sul pulsante On/Off e impostandola sulla massima potenza facendo clic e trascinando la barra fino in fondo verso destra. Aprire l'area del campione e rimuovere il supporto del campione dallo stadio del microscopio.
Quindi aggiungere la cella di flusso e fissarla con i portacampioni metallici, assicurandosi che il vetrino di copertura sia sul fondo. Successivamente, aggiungere 30 microlitri di acqua RO al centro dell'obiettivo inferiore e reinserire lo stadio del campione. Quindi sollevare l'obiettivo inferiore utilizzando l'L2 sul telecomando fino a quando il tallone d'acqua tocca il vetrino del coperchio.
Quindi, abbassare l'obiettivo superiore fino a raggiungere circa la metà della distanza dalla cella di flusso utilizzando l'R2 sul telecomando. Quindi, aggiungere 170 microlitri di acqua RO nella parte superiore della cella di flusso direttamente sotto l'obiettivo superiore e abbassare l'obiettivo superiore fino a quando non rompe la tensione superficiale dell'acqua e forma un menisco. Successivamente, spostare lo stadio del microscopio utilizzando il pad freccia sul telecomando fino a raggiungere il bordo del nastro adiacente al canale di flusso, quindi chiudere lo sportello del campione.
Utilizzando la finestra dell'obiettivo sullo schermo, portare il bordo del nastro e mettere a fuoco portando l'obiettivo inferiore denominato Obiettivo laser verso l'alto facendo clic sulla freccia superiore e sull'obiettivo superiore facendo clic sulla freccia inferiore utilizzando i controlli sullo schermo. Trova una perlina galleggiante e intrappolala facendo clic sul pulsante di scatto della trappola, che aprirà l'otturatore e consentirà al laser di intrappolare il campione. Quindi, fai clic sul cursore dell'abbondanza sullo schermo e trascinalo per spostare la posizione del laser di trapping.
Una volta intrappolato, calibrare il tallone facendo clic sul pulsante di calibrazione. Quindi, fai clic su Impostazioni e digita il diametro del tallone e la temperatura del palco che si trova in basso a sinistra della finestra del software. Quindi, fai clic su Trappola 1, quindi su X Signal ed esegui l'adattamento della frequenza d'angolo facendo clic su Esegui.
Quindi fare clic e trascinare all'interno della finestra per ottimizzare la funzione di adattamento. Successivamente, fare clic su Usalo per i valori di sensibilità e rigidità e quindi accettare i valori. Successivamente, chiudi la finestra.
Trova un fascio di actomiosina cercando perline legate alle AF sulla superficie del vetrino di copertina e cercando entrambe le AF fluorescenti co-localizzate. Accendere la sorgente di luce bianca e utilizzare il cubo filtrante appropriato per visualizzare ciascun filamento di actina ruotando la torretta. Una volta verificato, intrappolare il tallone attaccato al filamento superiore del fascio facendo clic sul pulsante di scatto della trappola.
Quindi, registrare i dati facendo clic sul pulsante dell'oscilloscopio utilizzando i controlli su schermo. Per visualizzare le misurazioni senza registrare i dati, fare clic su Start e quindi fare clic su Autosave per salvare tutti i dati. Per registrare le misurazioni, clicca su Start record e scegli quali dati devono essere visualizzati in tempo reale scegliendo dal menu a tendina X Signal o Y Signal.
La traccia di forza dei motori scheletrici della miosina che generano forza all'interno della gerarchia strutturale di actina costruita in vitro mostra una rampa costante in forza fino a raggiungere un plateau in due o cinque minuti. Tuttavia, si osserva anche che alcuni fasci di actomiosina che non generano alcuna forza netta e le tracce di forza appaiono come rumore basale o non mostrano un sostanziale aumento netto della forza oltre i 90 secondi a causa di una bassa concentrazione del motore o di un orientamento parallelo sfavorevole dei filamenti. Questo sviluppo del protocollo aprirà la strada alla costruzione di saggi citoscheletrici in vitro più complessi che aiuteranno ulteriormente a modellare compiti cellulari su larga scala, come la divisione cellulare e la contrazione muscolare dal basso verso l'alto.
