La investigación del comportamiento de la actina utilizando este protocolo es importante porque permite al usuario sondear la dinámica del conjunto de proteínas motoras utilizando la precisión del atrapamiento óptico. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de medir la mecánica de la miosina dentro de la jerarquía estructural de actina, a diferencia de la orientación tradicional de un solo filamento de un solo motor utilizada en muchos experimentos de captura óptica. Otra ventaja de este protocolo es su naturaleza modular, que permite al usuario personalizar el ensayo al sistema de citoesqueleto jerárquico de su elección.
Para comenzar, aplique dos piezas de cinta adhesiva de doble cara en el centro de un portaobjetos de microscopio a tres o cuatro milímetros de distancia entre sí. Luego rasgue o corte el exceso de cinta que cuelga del borde de la diapositiva. A continuación, agregue el deslizamiento de la cubierta recubierto con PLL en la parte superior de la cinta perpendicular al eje largo del portaobjetos del microscopio para formar un canal.
Usando un pequeño tubo para comprimir el deslizamiento de la cubierta sobre la cinta y el microscopio, deslice completamente hasta que la cinta sea transparente, asegurándose de que no haya burbujas en la cinta, ya que esto puede causar fugas del canal de flujo. Agregue 15 microlitros de actina rodamina diluida a la celda de flujo PLL y absorba el exceso de solución a través de la celda de flujo, pero no permita que el canal de flujo se seque. Luego, incubar durante 10 minutos en una cámara de humedad.
A continuación, prepare una solución de caseína de un miligramo por mililitro en tampón de polimerización de actina y agregue 15 microlitros de la solución para evitar la unión no específica de los componentes posteriores. Luego, incubar durante cinco minutos en una cámara de humedad. Después, agregue la concentración deseada de miosina a la suspensión de actina y perlas biotiniladas preparadas y revuelva suavemente con la punta de una pipeta.
Luego, agregue inmediatamente 15 microlitros de la suspensión junto con la concentración de miosina deseada a la celda de flujo e incube durante 20 minutos. A continuación, selle los extremos abiertos de la celda de flujo con esmalte de uñas para evitar la evaporación durante los experimentos de captura óptica y de imágenes. Una vez que el sistema esté listo, encienda el láser usando el botón de encendido del láser en la esquina inferior izquierda de la pantalla a 50 milivatios y deje que se estabilice durante 30 minutos.
Haga clic secuencialmente en los botones de iluminación, cámara, objetivo y movimiento del escenario dentro del software para abrir esas ventanas para ver y manipular durante el experimento. Encienda la iluminación del microscopio haciendo clic en el botón de encendido / apagado y ajustándola a la máxima potencia haciendo clic y arrastrando la barra hasta la derecha. Abra el área de muestra y retire el portamuestras de la etapa del microscopio.
Luego agregue la celda de flujo y asegúrela con los soportes de muestras de metal, asegurándose de que el deslizamiento de la cubierta esté en la parte inferior. Luego, agregue 30 microlitros de agua RO al centro del objetivo inferior y vuelva a insertar la etapa de muestra. Luego levante el objetivo inferior usando el L2 en el control remoto hasta que la cuenta de agua toque el deslizamiento de la cubierta.
A continuación, baje el objetivo superior hasta que se alcance aproximadamente la mitad de la distancia a la celda de flujo utilizando el R2 en el control remoto. Luego, agregue 170 microlitros de agua RO a la parte superior de la celda de flujo directamente debajo del objetivo superior y baje el objetivo superior hasta que rompa la tensión superficial del agua y forme un menisco. Posteriormente, mueva la etapa del microscopio con la almohadilla de flecha del control remoto hasta que se alcance el borde de la cinta adyacente al canal de flujo y, a continuación, cierre la puerta de la muestra.
Usando la ventana de objetivo en la pantalla, traiga el borde de la cinta y enfoque levantando el objetivo inferior llamado Objetivo láser haciendo clic en la flecha superior y el objetivo superior haciendo clic en la flecha inferior usando los controles en pantalla. Encuentre una cuenta flotante y trampérela haciendo clic en el botón del obturador de la trampa, que abrirá el obturador y permitirá que el láser de captura golpee la muestra. Luego, haga clic en el cursor de captura en la pantalla y arrástrelo para mover la ubicación del láser de captura.
Una vez atrapado, calibre el talón haciendo clic en el botón de calibración. Luego, haga clic en Configuración y escriba el diámetro de la cuenta y la temperatura del escenario que se encuentra en la parte inferior izquierda de la ventana del software. A continuación, haga clic en Trap 1, luego en X Signal y realice el ajuste de frecuencia de esquina haciendo clic en Run.
Luego haga clic y arrastre dentro de la ventana para optimizar el ajuste de la función. Luego, haga clic en Usarlo para valores de sensibilidad y rigidez y luego acepte los valores. A continuación, cierre la ventana.
Encuentre un paquete de actomiosina buscando perlas unidas a AF en la superficie de la cubierta y buscando ambos AF fluorescentes colocalizados. Encienda la fuente de luz blanca y use el cubo de filtro apropiado para obtener imágenes de cada filamento de actina girando la torreta. Una vez verificado, atrape la cuenta unida al filamento superior del paquete haciendo clic en el botón del obturador de la trampa.
Luego, registre los datos haciendo clic en el botón del osciloscopio usando los controles en pantalla. Para visualizar las mediciones sin registrar los datos, haga clic en Inicio y luego haga clic en Autoguardar para guardar todos los datos. Para registrar mediciones, haga clic en Iniciar registro y elija qué datos se visualizarán en tiempo real eligiendo en el menú desplegable Señal X o Señal Y.
La traza de fuerza de los motores de miosina esquelética que generan fuerza dentro de la jerarquía estructural de actina in vitro construida exhibe una rampa constante en la fuerza hasta que se alcanza una meseta durante dos a cinco minutos. Sin embargo, también se observa que algunos haces de actomiosina que no generan ninguna fuerza neta y las trazas de fuerza aparecen como ruido de referencia o no exhiben un aumento neto sustancial de la fuerza durante 90 segundos debido a una baja concentración del motor o una orientación paralela desfavorable de los filamentos. Este desarrollo del protocolo allanará el camino hacia la construcción de ensayos citoesqueléticos in vitro más complejos que ayudarán aún más a modelar tareas celulares a gran escala, como la división celular y la contracción muscular de abajo hacia arriba.
