يصف هذا البروتوكول كيفية هندسة 3D وظيفية في المختبر التقاطعات العصبية العضلية البشرية التي يمكن استخدامها للتحقيق في الأمراض العصبية العضلية واختبار العلاجات المحتملة. تستخدم هذه التقنية التحفيز البصري الوراثي المتزامن ومعالجة الفيديو. إنها تغيرات كمية في وظيفة الوصلة العصبية العضلية أثناء التطور وبسبب عوامل خارجية ، مثل السموم العصبية والمصل من مرضى الوهن العضلي الوبيل.
يمكن أن تكون الخطوات التي تنطوي على بذر الخلية العضلية والخلايا العصبية الحركية في المفاعل الحيوي صعبة في البداية. يمكن أن يساعد الاحتفاظ بخليط هلام الكولاجين على الجليد في إطالة الوقت المتاح لزرع جميع الخلايا قبل أن يتصلب الهلام. ابدأ بخلط قاعدة 10 إلى 1 لعلاج خليط عامل من polydimethylsiloxane ، أو PDMS ، ووضع الخليط في غرفة فراغ.
أغلق جميع الصمامات وقم بتشغيل الفراغ لتفريغ الخليط لمدة 30 دقيقة على الأقل حتى لا تبقى فقاعات الهواء. صب الخليط في قوالب وإزالة القوالب في غرفة الفراغ لمدة 1 ساعة ، ثم أغلق القوالب مع النصف العلوي من القالب في الاتجاه الصحيح. ضع قضيبا فولاذيا سداسيا فوق الوسط وقم بالمشبك على كلا الجانبين.
بعد ذلك ، أعد ملء الجزء العلوي ب PDMS وعالج القوالب في فرن 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل. بعد أن تبرد القوالب إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة المنصات من القوالب. وفي الوقت نفسه ، ينزلق الغطاء الزجاجي في 1٪ من البوليول السطحي غير الأيوني لمدة 30 دقيقة ، مما يضمن عدم تكديس انزلاقات الغطاء وكلها مغلفة بشكل صحيح ، ثم شطفها جيدا بالماء المقطر وتجفيفها بين عشية وضحاها عند 65 درجة مئوية.
عالج زلات الغطاء الزجاجي ومنصة PDMS باستخدام منظف بلازما على ارتفاع عال مع 6 لترات في الدقيقة من الأكسجين لمدة 1 إلى 2 دقيقة. بمجرد معالجتهما ، اربطهما معا عن طريق الضغط على PDMS لأسفل على شريحة الغطاء لمدة 30 ثانية على الأقل. تحضير مزيج 4 إلى 1 من 3 ملليغرام لكل ملليلتر كولاجين 1 ومصفوفة غشاء قبو قابل للذوبان ، ثم أعد تعليق الخلايا العضلية في خليط الكولاجين المحضر حديثا.
بعد ذلك ، أضف 15 ميكرولتر من هذا التعليق الخلوي الكولاجين إلى كل غرفة عضلية في المفاعل الحيوي ، مع التأكد من نشر التعليق عبر كلا العمودين باستخدام طرف الماصة. اسمح لخليط هلام الخلية بالبلمرة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم املأ كل مفاعل حيوي جيدا ب 450 ميكرولتر من وسائط النمو العضلي. في اليوم 11 من تمايز motoneuron ، انقل الخلايا والوسائط إلى أنبوب 50 ملليلتر واسمح للغلاف العصبي بالاستقرار في القاع لمدة 5 دقائق.
شفط supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 15 ملليلتر من وسط ثقافة تعليق motoneuron مع استكمال 20 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل التغذية العصبية المشتقة من الدماغ و 10 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل التغذية العصبية المشتقة من الخلايا الدبقية. في اليوم 14 من بروتوكولات التمايز ، قم بزرع الخلايا العصبية المتحركة في المنصة. تحضير خليط هلام 4 إلى 1 من 2 ملليغرام لكل ملليلتر كولاجين 1 ومصفوفة غشاء قبو قابلة للذوبان.
استخدم مصفاة خلايا 400 نانومتر لاختيار الأغلفة العصبية الكبيرة وإعادة تعليقها في خليط الجل المحضر. استنشق الوسائط بعناية من الخزان والغلاف العصبي جيدا ، ثم أضف 15 ميكرولتر من خليط الجل إلى قناة الغلاف العصبي. قم بتحميل ماصة سعة 10 ميكرولتر مع 10 ميكرولترات من الجل واختر طبقة عصبية واحدة.
قم بإيداع الغلاف العصبي في قناة الغلاف العصبي ، مما يضمن وجوده في الغرفة ، ثم ارفع الماصة ببطء أثناء إطلاق الجل المتبقي بمجرد ترسب الغلاف العصبي. اسمح للهلام بالبلمرة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، ثم أضف 450 ميكرولتر من NbActiv4 مع 20 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ و 10 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل التغذية العصبية المشتق من الخلايا الدبقية إلى الخزانات. للتصوير ، استخدم مجهر فلورسنت مقلوب مع برنامج كاميرا أشباه الموصلات التكميلي العلمي لأكسيد المعادن.
اضبط الربط على 2 × 2 ، والتعرض ل 20 مللي ثانية ، وتشغيل الغالق المتداول ، ومعدل القراءة على 540 ميجاهرتز ، والنطاق الديناميكي على 12 بت ، ووضع الكسب 1 ووضع المستشعر للتداخل. استخدم هدفا 2x على المجهر لتصوير الأنسجة الدقيقة وإرفاق غرفة خلية حية بمرحلة المجهر. حدد المنطقة ذات الأهمية التي تحتوي على أنسجة الهيكل العظمي المعصوبة لتقليل حجم الملف ووقت المعالجة، ثم ضع مرشح انبعاث طويل التمرير بقدرة 594 نانومتر بين العينة وهدف التصوير لتصفية نبضات الضوء الأزرق من الكاميرا.
بعد ذلك ، ضع لوحة مستطيلة من 4 آبار تحتوي على أربعة مفاعلات حيوية في غرفة الخلايا الحية ، ثم انقر فوق العرض المباشر والتوسيط وركز الصورة باستخدام عائد الاستثمار المطلوب. قم بتنزيل رمز الماكرو المخصص من مجلد GitHub للتحكم في موضع المسرح ولوحة Arduino واكتساب الفيديو، ثم قم بتعيين فيلم الإخراج كتسطير سفلي يوم مجموعة الأنسجة تسطير اسم النسيج تسطير التجربة نقطة ND2. قم بتشغيل رمز الماكرو مع تعيين إحداثيات X و Y المطلوبة على المسرح والحصول على فاصل زمني سريع مع 1700 إطار بمعدل 50 إطارا في الثانية.
بعد التصوير ، استبدل الوسائط وأعد العينات إلى الحاضنة. اسمح ب 24 ساعة على الأقل بين جلسات التقاط الصور لتجنب إرهاق الأنسجة. لمعالجة الأفلام ، قم بتنزيل الملفات من مجلد GitHub واستخدم رمز MATLAB المخصص لمعالجة مقاطع الفيديو في تحليل الدفعات.
افتح البرنامج النصي لتحليل نظام التشغيل التكراري للحصول على جميع مقاطع الفيديو المكتسبة في نفس المجلد. اضبط معلمات التحليل المسبق وقم بتشغيل البرنامج النصي التكراري OSAnalysis لتحليل الأفلام من خلال المعالجة المتوازية. اضبط معلمات ما بعد التحليل مثل وقت خط الأساس وعتبة الذروة وبروز الحد الأدنى والعرض الأدنى حسب الحاجة.
أخيرا ، قم بإنشاء إخراج فيديو ورسم بياني عن طريق تشغيل recursiveOSMovie لإنشاء ملف فيديو لكل نسيج مع تتبع الانقباض الخاص به. تم اختبار هذا البروتوكول باستخدام نظامين بمقاييس مختلفة ، وهو جهاز الموائع الدقيقة ينتج أنسجة عضلية هيكلية طولها 1 ملليمتر تضم حوالي 20،000 من الأرومة العضلية ونظام المفاعل الحيوي المفتوح البئر مما يؤدي إلى أنسجة عضلية بطول 4 ملليمترات تضم حوالي 450 من الأرومة العضلية. تم بناء إعداد بصري للسماح بالتحفيز المتحكم فيه للخلايا العصبية المتحركة مع الضوء الأزرق وتم رفع وظيفة NMJ باستخدام برنامج نصي ماكرو مجهري مخصص مقترن برمز Arduino مخصص.
يتضمن هذا الرمز معلمات قابلة للتعديل قابلة للتعديل ويحدد ما إذا كان يتم تشغيل الانكماش بناء على الوقت بين نبضة الضوء وبداية ذروة الانقباض. التقط النظام تحسنا في وظيفة NMJ في الأنسجة مما يدل على زيادة في الاستجابات المثيرة بعد أسبوع واحد من تصنيع الأنسجة ، تليها وظيفة مستقرة لمدة أسبوع إضافي. أوقف ألفا بونغاروتوكسين جميع الانقباضات المثيرة والتلقائية مما أدى إلى اضطراب كامل في وظيفة NMJ ، مما يدل على أن التحفيز الضوئي للأنسجة يتطلب NMJ وظيفيا.
أظهر تحليل الأنسجة المعالجة بمصل الوهن العضلي الوبيل بنسبة 20٪ لمدة 48 ساعة انخفاضا في الوظيفة مقارنة بالأنسجة الضابطة المعالجة بالمصل من متبرعين أصحاء. بعد 48 ساعة من إزالة المصل وغسله ، أظهرت NMJs الهندسية استعادة الوظيفة. تأكد من وجود جميع المفاعلات الحيوية في الفرن لفترة متساوية لتجنب تباين الصلابة بين الدفعات.
تأكد أيضا من التحقق من بذر الخلايا العصبية الحركية باستخدام المجهر. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء فحص metabalomics و proteomics و CRISPR لجمع معلومات إضافية وفهم أفضل للتغيرات الميكانيكية الناجمة عن المصل المريض.
