معرفة التوافر البيولوجي للحديد أمر ضروري لتقييم الجودة الغذائية للحديد في الأطعمة. تم تطوير المقايسة الحيوية لخلايا Caco-2 لتلبية هذه الحاجة البحثية الحرجة. هذا الفحص الحيوي هو نهج فعال من حيث التكلفة وعالي الإنتاجية لتحديد التوافر البيولوجي للحديد من الوجبات الغذائية المختلفة.
يمكن استخدامه لتوصيف العوامل التي تؤثر على التوافر البيولوجي للحديد ، والتكرير في أهداف دراسة الجسم الحي. سيوضح الإجراء يونغ بي تشانغ ، وهو فني أبحاث من مختبري. للبدء ، قم بزراعة خلايا Caco-2 لمدة 7 إلى 10 أيام ، وبمجرد توفر خلايا كافية ، قم بزرع الخلايا في قارورة غير مغلفة بالكولاجين.
ثم تنمو الخلايا في قوارير لمدة سبعة أيام وتغيير الوسط في يوم بديل. في اليوم السابع ، استخدم الخلايا لبذر الألواح متعددة الآبار. زرع خلايا Caco-2 بكثافة 50،000 خلية لكل سنتيمتر مربع في ست لوحات مغلفة بالكولاجين جيدا.
أضف DMEM المكمل ب HEPES و FBS ومحلول مضاد للفطريات مضاد حيوي بنسبة 1٪ إلى اللوحات. ثم احتضن لمدة 12 يوما عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. استمر في تغيير الوسيط كل يومين على الأقل وفقا لجدول يومي ثابت.
ثم إعداد الحد الأدنى من الوسط الأساسي المكمل بالأنابيب ، محلول مضاد للفطريات مضاد للفطريات ، هيدروكورتيزون ، أنسولين ، سيلينيوم ، ثلاثي يودوثيرونين وعامل نمو البشرة. استبدل وسط الثقافة بملليلترين من هذا الوسط المحضر. في اليوم التالي ، استبدله بملليلتر واحد من الحد الأدنى من الوسط الأساسي عند الرقم الهيدروجيني 7.
الآن قم بإنشاء حلقة إدراج معقمة باستخدام حلقة O من السيليكون مزودة بغشاء غسيل الكلى المغسول بالحمض. في اليوم الثالث عشر ، قم بإزالة الإدخالات من الثلاجة ، واستنزاف الماء واستبداله ب 0.5 حمض الهيدروكلوريك المولي. اتركيه في غطاء تدفق صفائحي لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل الاستخدام.
ثم استنزاف 0.5 حمض الهيدروكلوريك مولي وشطف بالماء المعقم 18 ميجا أوم. يخزن في ماء معقم 18 ميجا أوم في غطاء تدفق صفائحي حتى يصبح جاهزا للاستخدام. قم بإنشاء نظام من غرفتين عن طريق إدخال حلقة في الآبار تحتوي على خلايا صفيحة البئر الستة ثم إعادة اللوحة مع الإدخالات إلى الحاضنة.
لإعداد محلول البنكرياس الصفراوي ، أضف 87.5 جراما من راتنج تبادل الكاتيون الضعيف إلى البنكرياس المذاب ومستخلص الصفراء واستخدم شاكر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لخلط المكونات. صب الطين في عمود كبير واستنزاف العمود. ثم الطرد المركزي للعمود الشفاف.
قم بوزن العينة في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 ملليلتر. اضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام حمض الهيدروكلوريك وأضف 10 ملليلتر من المالحة الفسيولوجية التي تحتوي على 140 ملليمولار كلوريد الصوديوم وخمسة ملليمولار كلوريد البوتاسيوم. ثم اضبط عملية هضم المعدة عن طريق إضافة 0.5 ملليلتر من محلول البيبسين الخنزير المحضر إلى العينة.
بعد ذلك ، احتضن على شاكر هزاز في وضع لطيف لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية وابدأ عملية الهضم المعوية لكل عينة عن طريق ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.5 إلى 6.0 مع 1.0 بيكربونات الصوديوم المولية. أضف 2.5 ملليلتر من محلول الصفراء البنكرياس إلى كل أنبوب عينة واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.9 إلى 7.0 مع 1.0 بيكربونات الصوديوم المولية. باستخدام المحلول الذي يحتوي على 140 ملليمولار كلوريد الصوديوم وخمسة ملليمولار كلوريد البوتاسيوم ، أضف السوائل بحيث يحتوي كل أنبوب على 15 جراما بالضبط من إجمالي المواد.
الآن انقل 1.5 ملليلتر من كل هضم معوي إلى الغرفة العلوية للبئر التي تحتوي على خلايا Caco-2 في لوحة زراعة البئر الستة. استبدل غطاء اللوحة واحتضنه عند 37 درجة مئوية في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون على شاكر هزاز عند ستة تذبذبات في الدقيقة لمدة ساعتين. قم بإزالة حلقة الإدراج مع الملخص.
ثم أضف ملليلتر واحد من الحد الأدنى من الوسط الأساسي عند درجة الحموضة 7 إلى كل بئر واحتفظ بالطبق مرة أخرى في الحاضنة لمدة 22 ساعة. الآن قم بإزالة وسط زراعة الخلايا وأضف ملليلترين من الماء 18 ميجا أوم إلى الطبقة الأحادية الخلية. انقله إلى سونيكتور وحصاد محللات الخلية بأكملها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لبروتين الخلية وتحليلات فيريتين الخلية.
أظهرت أصناف مانتيكا توافرا أعلى للحديد مقارنة بالضوابط المرجعية لفئات الألوان البيضاء والحمراء على غرار عامين متتاليين من الحصاد. أظهر التوافر البيولوجي للحديد من أصناف الفاصوليا البيضاء والصفراء زيادة بعد معالجتها في الدقيق. ومع ذلك ، أظهر التوافر البيولوجي للحديد انخفاضا في أصناف التوت البري والكلى الحمراء والسوداء.
يعد الاستزراع السليم لخلية Caco-2 أحادية الطبقة ضروريا للاستخدام الناجح لهذه المقايسة الحيوية. الاهتمام الدقيق بتفاصيل النمو والصيانة هو المفتاح للاستجابة المتسقة للفحص الحيوي. ينفي هذا النموذج عيوب النهج الأخرى وتكلفتها العالية ويمكن الباحثين من تحديد الآليات وتقييم العوامل التي تمنع وتعزيز التوافر البيولوجي للحديد بشكل كامل.
