ידע על זמינות ביולוגית של ברזל חיוני להערכת האיכות התזונתית של ברזל במזונות. הבדיקה הביולוגית של תאי Caco-2 פותחה כדי לענות על הצורך המחקרי הקריטי הזה. בדיקה ביולוגית זו היא גישה חסכונית ותפוקה גבוהה לקביעת זמינות ביולוגית של ברזל מדיאטות שונות.
ניתן להשתמש בו כדי לאפיין גורמים המשפיעים על הזמינות הביולוגית של ברזל, ולשכלל את מטרות המחקר in vivo. מי שידגים את ההליך יהיה יונגפיי צ'אנג, טכנאי מחקר מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, תרבית את תאי Caco-2 במשך 7 עד 10 ימים, ולאחר מספיק תאים זמינים זרע את התאים בקבוקון שאינו מצופה קולגן.
לאחר מכן לגדל את התאים צלוחיות במשך שבעה ימים ולשנות את המדיום ביום חלופי. ביום השביעי השתמשו בתאים לזריעת הצלחות הרב-באריות. זרע את תאי Caco-2 בצפיפות של 50, 000 תאים לסנטימטר מרובע בשש צלחות מצופות קולגן היטב.
הוסיפו לצלחות תוסף DMEM עם HEPES, FBS ו-1% תמיסה אנטיביוטית אנטי-מיקוטית. לאחר מכן לדגור במשך 12 ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. המשך לשנות את המדיום לפחות כל יומיים בלוח זמנים יומי קבוע.
לאחר מכן הכינו מדיום חיוני מינימלי בתוספת צינורות, תמיסה אנטיביוטית אנטי-מיקוטית, הידרוקורטיזון, אינסולין, סלניום, טריודותירונין וגורם גדילה אפידרמלי. החלף את מדיום התרבות בשני מיליליטר של מדיום מוכן זה. למחרת, להחליף אותו עם מיליליטר אחד של המדיום החיוני המינימלי ב- pH 7.
כעת צרו טבעת החדרה מעוקרת באמצעות טבעת O מסיליקון המצוידת בקרום דיאליזה שטוף חומצה. ביום ה -13, להסיר את התוספות מהמקרר, לנקז ולהחליף את המים עם 0.5 חומצה הידרוכלורית טוחנת. השאירו אותו במכסה מנוע למינרי למשך שעה לפחות לפני השימוש.
לאחר מכן לנקז 0.5 חומצה הידרוכלורית טוחנת ולשטוף עם מים סטריליים 18 מגה אוהם. יש לאחסן במים סטריליים של 18 מגה-אוהם במכסה מנוע למינרי עד שיהיה מוכן לשימוש. צור מערכת דו-קאמרית על ידי הכנסת טבעת לתוך הבארות המכילות את התאים של צלחת שש הבארות ולאחר מכן החזרת הצלחת עם התוספות לאינקובטור.
להכנת תמיסת pancreatin-מרה, להוסיף 87.5 גרם של שרף חילופי קטיון חלש ללבלב solubilized ותמצית מרה ולהשתמש שייקר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לערבב את הרכיבים. יוצקים את הבוץ לתוך עמוד גדול ומנקזים את העמוד. לאחר מכן צנטריפוגה העמודה eluent.
שקול את הדגימה בצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מיליליטר. התאם את ה- pH באמצעות חומצה הידרוכלורית והוסף 10 מיליליטר של מלח פיזיולוגי המכיל 140 מילימולאר נתרן כלורי וחמישה מילימולאר אשלגן כלורי. לאחר מכן להגדיר את תהליך העיכול קיבה על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של פתרון פפסין חזיר מוכן לדגימה.
לאחר מכן דגירה על שייקר נדנדה בסביבה עדינה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ולהתחיל את תהליך העיכול במעיים של כל דגימה על ידי התאמת ה- pH ל 5.5 עד 6.0 עם 1.0 סודיום ביקרבונט טוחן. הוסף 2.5 מיליליטר של תמיסת מרה pancreatin לכל צינור דגימה ולהתאים את ה- pH ל 6.9 עד 7.0 עם 1.0 סודיום ביקרבונט טוחן. באמצעות תמיסה המכילה 140 מילימולאר נתרן כלורי וחמישה מילימולאר אשלגן כלורי, מוסיפים נוזלים כך שכל צינור מכיל בדיוק 15 גרם של חומר כולל.
עכשיו להעביר 1.5 מיליליטר של כל עיכול מעיים לתוך החדר העליון של הבאר המכיל את התאים Caco-2 של צלחת תרבית שש באר. יש להחליף את מכסה הצלחת ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני על שייקר מתנדנד בשש תנודות לדקה למשך שעתיים. הסר את טבעת ההוספה עם העיכול.
לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום חיוני מינימלי ב- pH 7 לכל באר ושומרים את הצלחת בחזרה באינקובטור למשך 22 שעות. עכשיו להסיר את המדיום תרבית התא ולהוסיף שני מיליליטר של 18 מגה אוהם מים לשכבת מונו התא. מעבירים אותו לסוניקטור וקוצרים את כל התא ליזאט לצינורות מיקרו-צנטריפוגה לניתוח חלבון התא ופריטין תא.
זני המנטקה הראו זמינות ברזל גבוהה יותר ביחס לבקרות ייחוס של מחלקות הצבעים במודלים של לבן ואדום במשך שתי שנות קציר רצופות. הזמינות הביולוגית של הברזל מזני שעועית לבנה וצהובה הראתה עלייה לאחר עיבודם לקמח. עם זאת, הזמינות הביולוגית של הברזל הראתה ירידה בזנים חמוציות, כליות אדומות ושחורות.
גידול חד-שכבתי תקין של תאי Caco-2 חיוני לשימוש מוצלח בביו-אסאי זה. תשומת לב מדויקת לפרטי הגידול והתחזוקה היא המפתח לתגובה עקבית של הבדיקה הביולוגית. מודל זה שולל את החסרונות והעלות הגבוהה של גישות אחרות ומאפשר לחוקרים לזהות מנגנונים ולהעריך באופן מלא יותר גורמים המעכבים ומקדמים זמינות ביולוגית של ברזל.
