Die Kenntnis der Bioverfügbarkeit von Eisen ist für die Beurteilung der ernährungsphysiologischen Qualität von Eisen in Lebensmitteln unerlässlich. Der Caco-2-Zellbioassay wurde entwickelt, um diesen kritischen Forschungsbedarf zu decken. Dieser Bioassay ist ein kostengünstiger Hochdurchsatzansatz zur Bestimmung der Eisenbioverfügbarkeit aus verschiedenen Diäten.
Es kann verwendet werden, um Faktoren zu charakterisieren, die die Bioverfügbarkeit von Eisen beeinflussen, und um In-vivo-Studienziele zu verfeinern. Yongpei Chang, ein Forschungstechniker aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren. Um zu beginnen, kultivieren Sie die Caco-2-Zellen für 7 bis 10 Tage, und sobald genügend Zellen verfügbar sind, säen Sie die Zellen in einem nicht kollagenbeschichteten Kolben.
Dann wachsen die Zellen sieben Tage lang in Kolben und wechseln Sie das Medium an einem anderen Tag. Am siebten Tag verwenden Sie die Zellen zur Aussaat der Multi-Well-Platten. Samen Sie die Caco-2-Zellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Quadratzentimeter in sechs gut kollagenbeschichteten Platten.
Fügen Sie DMEM, ergänzt mit HEPES, FBS und 1% antibiotischer antimykotischer Lösung, zu den Platten hinzu. Dann 12 Tage bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid inkubieren. Wechseln Sie das Medium mindestens alle zwei Tage nach einem einheitlichen Tagesplan.
Dann bereiten Sie ein minimales essentielles Medium vor, das mit Rohren, antibiotischer antimykotischer Lösung, Hydrocortison, Insulin, Selen, Trijodthyronin und epidermalem Wachstumsfaktor ergänzt wird. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch zwei Milliliter dieses vorbereiteten Mediums. Am nächsten Tag ersetzen Sie es durch einen Milliliter des minimalen essentiellen Mediums bei pH 7.
Erstellen Sie nun einen sterilisierten Einlegering aus einem Silikon-O-Ring, der mit einer säuregewaschenen Dialysemembran ausgestattet ist. Am 13. Tag die Einsätze aus dem Kühlschrank nehmen, abtropfen lassen und das Wasser durch 0,5 molare Salzsäure ersetzen. Lassen Sie es vor Gebrauch mindestens eine Stunde in einer Laminar-Flow-Haube.
Dann 0,5 molare Salzsäure abtropfen lassen und mit sterilem 18 Megaohm Wasser abspülen. In sterilem 18-Megaohm-Wasser in einer Laminar-Flow-Haube aufbewahren, bis sie einsatzbereit ist. Erstellen Sie ein Zwei-Kammer-System, indem Sie einen Ring in die Vertiefungen einführen, der die Zellen der Sechs-Well-Platte enthält, und dann die Platte mit den Einsätzen in den Inkubator zurückbringen.
Zur Herstellung der Pankreatin-Gallen-Lösung fügen Sie 87,5 Gramm schwaches Kationenaustauscherharz zu dem gelösten Pankreatin- und Gallenextrakt hinzu und verwenden Sie einen Shaker für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um die Komponenten zu mischen. Gießen Sie die Gülle in eine große Säule und lassen Sie die Säule abtropfen. Dann zentrifugieren Sie den Säuleneluent.
Wiegen Sie die Probe in einem sterilen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen ab. Stellen Sie den pH-Wert mit Salzsäure ein und fügen Sie 10 Milliliter physiologische Kochsalzlösung hinzu, die 140 Millimolar Natriumchlorid und fünf Millimolar Kaliumchlorid enthält. Stellen Sie dann den Magenverdauungsprozess ein, indem Sie 0,5 Milliliter der vorbereiteten Schweinepepsinlösung in die Probe geben.
Als nächstes auf einem Schaukelschüttler bei sanfter Einstellung für eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren und den Darmverdauungsprozess jeder Probe einleiten, indem der pH-Wert mit 1,0 molärem Natriumbicarbonat auf 5,5 bis 6,0 eingestellt wird. Fügen Sie 2,5 Milliliter der Pankreatin-Gallenlösung zu jedem Probenröhrchen hinzu und stellen Sie den pH-Wert mit 1,0 molärem Natriumbicarbonat auf 6,9 bis 7,0 ein. Unter Verwendung der Lösung, die 140 Millimolar Natriumchlorid und fünf Millimolar Kaliumchlorid enthält, werden Flüssigkeiten hinzugefügt, so dass jedes Röhrchen genau 15 Gramm Gesamtmaterial enthält.
Nun werden 1,5 Milliliter jedes Darmverdaus in die obere Kammer des Brunnens überführt, der die Caco-2-Zellen der sechs Vertiefungskulturplatten enthält. Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid auf einem Schaukelschüttler bei sechs Schwingungen pro Minute für zwei Stunden. Entfernen Sie den Einsteckring mit dem Digest.
Dann fügen Sie einen Milliliter des minimalen essentiellen Mediums bei pH 7 in jede Vertiefung und halten Sie die Platte 22 Stunden lang im Inkubator. Entfernen Sie nun das Zellkulturmedium und geben Sie zwei Milliliter 18 Megaohm Wasser in die Zellmonoschicht. Übertragen Sie es in einen Ultraschallgerät und ernten Sie das gesamte Zelllysat in Mikrozentrifugenröhrchen für Zellprotein- und Zellferritinanalysen.
Die Manteca-Sorten zeigten eine höhere Eisenverfügbarkeit im Vergleich zu Referenzkontrollen der weißen und roten modellierten Farbklassen für zwei aufeinanderfolgende Erntejahre. Die Eisenbioverfügbarkeit von weißen und gelben Bohnensorten zeigte eine Zunahme nach der Verarbeitung zu Mehl. Die Eisenbioverfügbarkeit zeigte jedoch eine Abnahme der Cranberry-, roten Nieren- und schwarzen Sorten.
Die richtige Caco-2-Zell-Monolayer-Kultivierung ist für den erfolgreichen Einsatz dieses Bioassays unerlässlich. Die genaue Beachtung der Details des Wachstums und der Aufrechterhaltung ist der Schlüssel zur konsistenten Reaktion des Bioassays. Dieses Modell negiert die Nachteile und hohen Kosten anderer Ansätze und ermöglicht es Forschern, Mechanismen zu identifizieren und Faktoren, die die Eisenbioverfügbarkeit hemmen und fördern, umfassender zu bewerten.
