يمكن أن تعيق الزراعة خارج الجسم الحي إمكانات إعادة توطين الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية. يحافظ بروتوكولنا على الجذع أثناء المزرعة وبالتالي يحسن تواتر الخلايا المعدلة جينيا في الجسم الحي. يتم حاليا استخدام العلاج الجيني بالخلايا الجذعية المكونة للدم للأمراض أحادية المنشأ والأمراض المعدية مثل فيروس نقص المناعة البشرية.
يعتمد بروتوكول العلاج الجيني HSPC بشكل كبير على الثقافة خارج الجسم الحي. يجب أن يكون بروتوكولنا متوافقا مع أي إجراء يستخدم ثقافة خارج الجسم الحي. سيوضح هذا البروتوكول Vigneshwaran Venkatesan ، طالب دكتوراه من مختبري.
بعد عزل HSPCs ، قم بزراعتها في وسائط زراعة الخلايا الجذعية التي تحتوي على السيتوكينات والجزيئات الصغيرة Resveratrol و UM729 و StemRegenin1. قبل تحرير الجينات ، اضبط ThermoMixer على 37 درجة مئوية لإعادة تكوين الحمض النووي الريبي الموجه ، ثم سخن المخزن المؤقت TE عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بالطرد المركزي لقارورة sgRNA الاصطناعية المعدلة كيميائيا عند 11،000 مرة جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية وأضف 15 ميكرولترا من المخزن المؤقت TE إلى القارورة التي تحتوي على 1.5 نانومولار من sgRNA المجفف بالتجميد واخلطها عن طريق الدوران اللطيف للحصول على تركيز نهائي قدره 100 بيكومولار لكل ميكرولتر.
احتضان القارورة في ThermoMixer مع الحد الأدنى من الاهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 40 ثانية. اضغط برفق على القارورة على الجانبين وقم بتدوير القارورة لجمع 15 ميكرولتر من sgRNA. اصنع حصص 1 ميكرولتر وقم بتخزينها في 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى عام واحد.
للنواة ، بيليه 2 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة عن طريق الطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بمجرد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت. امزج تعليق الخلية برفق مع مركب RNP المحضر لتجنب فقاعات الهواء.
الآن ، قم بنقل التعليق إلى شريط nucleofection التجاري وقم بالكهرباء الخلايا باستخدام 4D-Nucleofector عن طريق تحديد رمز النبض DZ-100. إلى الخلايا المثقوبة بالكهرباء في شريط النواة ، أضف 100 ميكرولتر من وسائط الثقافة المحتضنة مسبقا واترك الخلايا دون إزعاج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، قم بنقل المحتويات إلى لوحة الاستزراع وفقا للمتطلبات التجريبية.
ضع فئران NSG في أقفاص الفطيرة في غضون 6 إلى 8 ساعات قبل زرع HSPC. قم بتشعيع الفئران عند 3.5 رمادي باستخدام جهاز تشعيع متاح تجاريا. بالنسبة ل NBSGW ، قم بالشرط المسبق للفئران من الذكور والإناث البالغة من العمر 6 إلى 8 أسابيع عن طريق حقن بوسلفان داخل الصفاق بجرعة 12.5 ملليغرام لكل كيلوغرام من وزن الجسم قبل 48 ساعة من زرع HSPC.
لغرس 1 فأر ، بيليه 6 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة في أنبوب 1.5 ملليلتر عن طريق الطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة 5 دقائق. في درجة حرارة الغرفة. ماصة بلطف خارج الطافي دون إزعاج بيليه وإعادة تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من PBS.
ضع فئران NSG أو NBSGW المكيفة مسبقا في مقيد الماوس وقم بغرس HSPCs عن طريق حقن الوريد الذيل. امسك ذيل الماوس وادفع القابس برفق لكبح جماح الماوس. امسح ذيل الماوس برفق بنسبة 70٪ إيثانول.
باستخدام حقنة الأنسولين قياس 31 ، نضح 100 ميكرولتر من تعليق الخلية. الآن ، قم بتوجيه الضوء من مصباح الأشعة تحت الحمراء إلى الذيل لمدة 30 إلى 40 ثانية ، مع تغطية منطقة جسم الماوس بطيات من المناديل الورقية. للحفاظ على الذيل في محور المسوي مع المحقنة ، ارفعه بإصبع السبابة الأيسر.
أدخل الجزء المائل من الإبرة برفق في الوريد الذيلي الأيسر أو الأيمن بزاوية 20 درجة. ادفع المكبس لبث تعليق الخلية في الوريد وتطبيق ضغط لطيف بالقرب من المنطقة المثقوبة بالمناديل الورقية واسحب الإبرة. بعد التخدير ، ضع الحيوان في رقد بطني وقم بتقشف الفئران برفق لفتح العين ، مما يسمح لكرة العين بالبروز قليلا.
أدخل ماصة المراعي برفق بزاوية 30 إلى 45 درجة في القنب الإنسي للعين تحت غشاء النيكت. بعد وضع ماصة باستور في الموضع المناسب ، اضغط ضغطا طفيفا على الأنبوب وابدأ في تدوير الأنبوب برفق. بعد جمع 50 إلى 80 ميكرولتر من الدم المحيطي ، اسحب الماصة برفق من القنثة الإنسية للعين.
بعد القتل الرحيم ، قم بعمل شق عمودي 1 سم فوق مجرى البول ويمتد حتى 1 سم تحت الحجاب الحاجز. قطع أفقيا في زوايا المنطقة المحفورة لفتح منطقة البطن. بعد تشريح عظم الفخذ والساق ، استخدم المقص لإزالة الأنسجة الرخوة المرتبطة بعظم الفخذ والساق وفرك العظام برفق باستخدام مناديل ورقية.
استخدم مشرطا لعمل ثقب صغير لا يزيد قطره عن 0.2 سم في قاع أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 ملليلتر. قم بإزالة الأطراف القريبة من العظام باستخدام مشرط وضع العظام بحيث يكون الجانب المقطوع متجها نحو فتحة أنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 0.5 ملليلتر. الآن ، ضع الأنبوب الذي سقطره 0.5 ملليلتر مع العظام في الأنبوب سعة 1.5 ملليلتر الذي يحتوي على 100 ميكرولتر من PBS المعقم.
أغلق الغطاء ، وقم بتدوير الأنابيب بمعدل 200 مرة جم لمدة 3 دقائق في ظل ظروف معقمة في درجة حرارة الغرفة وتخلص من الأنابيب سعة 0.5 ملليلتر التي تحتوي على عظام ذات تجويف نخاع فارغ. إلى أنبوب التفاعل 1.5 ملليلتر الذي يحتوي على نخاع العظم ، أضف 1 ملليلتر من PBS ، ثم باستخدام ماصة 1 ملليلتر ، أعد تعليق الخلايا برفق 10 مرات. انقل 1 ملليلتر من معلق الخلية إلى أنبوب حجمه 15 ملليلترا يحتوي على 9 ملليلتر من محلول تحلل كرات الدم الحمراء.
احتضان الخلايا في الثلج لمدة 7 دقائق عن طريق قلب الأنبوب برفق كل دقيقتين. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 200 مرة جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وكرر الغسيل حتى يتم ملاحظة حبيبات بيضاء شاحبة واضحة. زاد تواتر الخلايا الحية والخلايا الإيجابية CD34 والخلايا الإيجابية CD90 في مجموعة RUS بعد 48 ساعة من النواة.
بعد 72 ساعة ، زادت النسبة المئوية وتواتر الإندل في المجموعة المعالجة ب RUS مقارنة بالمجموعة المعالجة ب DMSO مما يشير إلى زيادة في تحرير الجينات. العدد المطلق للخلايا الإيجابية CD34 والخلايا الإيجابية CD90 وإجمالي الخلايا النواة أعلى بكثير بعد 48 ساعة من التحرير. أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا البشرية الإيجابية CD45 في فئران NSG زيادة في النقش في ظروف الثقافة.
أظهر تحليل تردد تحرير الجينات في خلايا BM للفأر زيادة في تطعيم HSPCs المحررة جينيا في ظروف الثقافة المكملة ب RUS. إن زراعة HSPCs عند التقاء 200،000 خلية لكل مل أمر بالغ الأهمية لتحسين الخلايا الجذعية الوظيفية. إن تضخيم الخلايا الجذعية لدم الحبل السري والخلايا الجذعية المشتقة من iSPC هي المجالات الجديدة التي يتم فيها اختبار هذا البروتوكول.
