Ex-vivo-Kultur kann das Wiederbesiedlungspotenzial von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen behindern. Unser Protokoll bewahrt die Stammhaut während der Kultur und verbessert so die Häufigkeit von genmodifizierten Zellen in vivo. Die Gentherapie mit hämatopoetischen Stammzellen wird derzeit bei monogenen Erkrankungen und Infektionskrankheiten wie HIV eingesetzt.
Das HSPC-Gentherapieprotokoll stützt sich stark auf Ex-vivo-Kultur. Unser Protokoll sollte mit jedem Verfahren kompatibel sein, das Ex-vivo-Kultur verwendet. Dieses Protokoll wird Vigneshwaran Venkatesan, Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren.
Nach der Isolierung der HSPCs kultivieren Sie sie in Stammzellkulturmedien, die Zytokine und kleine Moleküle Resveratrol, UM729 und StemRegenin1 enthalten. Stellen Sie den ThermoMixer vor der Genbearbeitung auf 37 Grad Celsius, um die Guide-RNA wiederherzustellen, und heizen Sie dann den TE-Puffer auf 37 Grad Celsius für 10 Minuten vor. Zentrifugieren Sie das synthetische chemisch modifizierte sgRNA-Fläschchen bei 11.000 mal g für 1 Minute bei 4 Grad Celsius und fügen Sie 15 Mikroliter TE-Puffer in die Durchstechflasche mit 1,5 Nanomolar lyophilisierter sgRNA und mischen Sie durch sanftes Schwenken, um eine Endkonzentration von 100 Picomolar pro Mikroliter zu erhalten.
Inkubieren Sie die Durchstechflasche im ThermoMixer mit minimalem Schütteln bei 37 Grad Celsius für 30 bis 40 Sekunden. Klopfen Sie vorsichtig auf die Durchstechflasche an den Seiten und drehen Sie die Durchstechflasche, um 15 Mikroliter sgRNA zu sammeln. Stellen Sie 1-Mikroliter-Aliquots her und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius für bis zu 1 Jahr.
Für die Nukleofektion Pellet 2 mal 10 zu den 5. Zellen durch Zentrifugieren bei 200 mal g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Sobald der Überstand verworfen ist, resuspendieren Sie das Pellet in 20 Mikrolitern des Puffers. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig mit dem vorbereiteten RNP-Komplex, um Luftblasen zu vermeiden.
Übertragen Sie nun die Suspension auf den handelsüblichen Nukleofektionsstreifen und elektropolieren Sie die Zellen mit dem 4D-Nucleofector durch Auswahl des Pulscodes DZ-100. Fügen Sie den elektropolierten Zellen im Nukleofektionsstreifen 100 Mikroliter vorinkubiertes Kulturmedium hinzu und lassen Sie die Zellen 10 Minuten bei Raumtemperatur ungestört. Am Ende der Inkubation wird der Inhalt gemäß den experimentellen Anforderungen auf die Kulturplatte überführt.
Legen Sie die NSG-Mäuse 6 bis 8 Stunden vor der HSPC-Transplantation in die Kuchenkäfige. Bestrahlen Sie die Mäuse bei 3,5 Grau mit einem handelsüblichen Bestrahlungsgerät. Für NBSGW, Vorbedingung 6 bis 8 Wochen alte männliche und weibliche Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Busulfan in einer Dosis von 12,5 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht 48 Stunden vor HSPC-Transplantation.
Zum Aufgießen von 1 Maus 6 mal 10 bis zur 5. Zelle in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen durch Zentrifugieren bei 200 mal g für 5 Minuten pelletieren. bei Raumtemperatur. Pipetten Sie den Überstand vorsichtig heraus, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikroliter PBS.
Legen Sie die vorkonditionierten NSG- oder NBSGW-Mäuse in das Maus-Resieb und infundieren Sie die HSPCs durch Schwanzveneninjektion. Halten Sie den Mausschwanz und drücken Sie vorsichtig auf den Stecker, um die Maus zurückzuhalten. Wischen Sie den Mausschwanz vorsichtig mit 70% Ethanol ab.
Mit einer 31-Gauge-Insulinspritze 100 Mikroliter der Zellsuspension absaugen. Richten Sie nun das Licht der Infrarotlampe für 30 bis 40 Sekunden auf den Schwanz und bedecken Sie den Körperbereich der Maus mit Falten aus Seidenpapier. Um den Schwanz mit der Spritze in der Hobelachse zu halten, heben Sie ihn mit dem linken Zeigefinger an.
Führen Sie den abgeschrägten Teil der Nadel vorsichtig in einem Winkel von 20 Grad in die linke oder rechte Schwanzvene ein. Drücken Sie den Kolben, um die Zellsuspension in die Vene zu infundieren, üben Sie sanften Druck in der Nähe der durchbohrten Region mit Seidenpapier aus und ziehen Sie die Nadel heraus. Nach der Narkose positionieren Sie das Tier in ventraler Liege und schrubben Sie die Mäuse vorsichtig, um das Auge zu öffnen, so dass die Augenkugel leicht hervorstehen kann.
Führen Sie die Weidepipette vorsichtig in einem Winkel von 30 bis 45 Grad in den medialen Knoten des Auges unter der Nickhaut ein. Nachdem Sie die Pasteur-Pipette in die richtige Position gebracht haben, üben Sie leichten Druck auf das Röhrchen aus und beginnen Sie, das Rohr sanft zu drehen. Nachdem Sie 50 bis 80 Mikroliter peripheres Blut gesammelt haben, ziehen Sie die Pipette vorsichtig aus dem medialen Canthus des Auges.
Machen Sie nach der Euthanasierung einen vertikalen Schnitt 1 Zentimeter über der Harnröhre und erstrecken Sie sich bis 1 Zentimeter unter das Zwerchfell. Schneiden Sie horizontal an den Ecken des eingeschnittenen Bereichs, um die Bauchregion zu öffnen. Nachdem Sie den Femur und die Tibia seziert haben, entfernen Sie mit einer Schere die Weichteile, die am Femur und der Tibia befestigt sind, und schrubben Sie die Knochen vorsichtig mit einem Seidenpapier.
Verwenden Sie ein Skalpell, um ein kleines Loch mit einem Durchmesser von nicht mehr als 0,2 Zentimetern am Boden eines 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens zu machen. Entfernen Sie die proximalen Enden der Knochen mit einem Skalpell und legen Sie die Knochen mit der geschnittenen Seite zum Loch des 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugationsröhrchens. Legen Sie nun das 0,5-Milliliter-Röhrchen mit den Knochen in das 1,5-Milliliter-Röhrchen, das 100 Mikroliter steriles PBS enthält.
Schließen Sie den Deckel, drehen Sie die Röhrchen bei 200 mal g für 3 Minuten unter sterilen Bedingungen bei Raumtemperatur und entsorgen Sie die 0,5-Milliliter-Röhrchen mit Knochen in einer leeren Markhöhle. In das 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen mit Knochenmark 1 Milliliter PBS geben und dann mit einer 1-Milliliter-Pipette die Zellen 10 Mal vorsichtig resuspendieren. 1 Milliliter der Zellsuspension wird in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 9 Milliliter RBC-Lysepuffer überführt.
Inkubieren Sie die Zellen für 7 Minuten in Eis, indem Sie die Röhre alle zwei Minuten vorsichtig umdrehen. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 mal g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und wiederholen Sie das Waschen, bis ein klares hellweißes Pellet beobachtet wird. Die Häufigkeit lebender Zellen und CD34-positiver, CD90-positiver Zellen hat in der RUS-Gruppe nach 48 Stunden Nukleofektion zugenommen.
Nach 72 Stunden nahmen der Prozentsatz und die Häufigkeit von Indel in der mit RUS behandelten Gruppe im Vergleich zur DMSO-behandelten Gruppe zu, was auf eine Zunahme der Geneditierung hindeutet. Die absolute Anzahl der CD34-positiven, CD90-positiven Zellen und der gesamten kernhaltigen Zellen ist 48 Stunden nach der Bearbeitung signifikant höher. Die Durchflusszytometrie-Analyse menschlicher CD45-positiver Zellen in den NSG-Mäusen zeigte eine erhöhte Anpflanzung unter den Kulturbedingungen.
Die Analyse der Gen-Editing-Häufigkeit in den BM-Zellen der Maus zeigte eine erhöhte Anpflanzung von geneditierten HSPCs unter RUS-ergänzten Kulturbedingungen. Die Kultivierung der HSPCs bei einem Zusammenfluss von 200.000 Zellen pro ml ist entscheidend für die Verbesserung der funktionellen Stammzellen. Die Amplifikation der Nabelschnurblut-Stammzellen und der iSPC-abgeleiteten Stammzellen sind die neuen Bereiche, in denen dieses Protokoll getestet wird.
