Ex vivo kültür, hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin repopulasyon potansiyelini engelleyebilir. Protokolümüz kültür sırasında saplığı korur ve böylece gen modifiye hücrelerin in vivo sıklığını arttırır. Hematopoetik kök hücre gen tedavisi şu anda monogenik hastalıklar ve HIV gibi bulaşıcı hastalıklar için kullanılmaktadır.
HSPC gen terapisi protokolü büyük ölçüde ex vivo kültüre dayanır. Protokolümüz, ex vivo kültürü kullanan herhangi bir prosedürle uyumlu olmalıdır. Bu protokolü gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencisi olan Vigneshwaran Venkatesan olacak.
HSPC'leri izole ettikten sonra, onları sitokinler ve küçük moleküller Resveratrol, UM729 ve StemRegenin1 içeren kök hücre kültürü ortamında kültürleyin. Gen düzenlemeden önce, kılavuz RNA'yı yeniden oluşturmak için ThermoMixer'ı 37 santigrat dereceye ayarlayın, ardından TE tamponunu 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede önceden ısıtın. Sentetik kimyasal olarak modifiye edilmiş sgRNA şişesini 4 santigrat derecede 1 dakika boyunca 11.000 kez g'de santrifüj edin ve 1.5 nanomolar liyofilize sgRNA içeren şişeye 15 mikrolitre TE tamponu ekleyin ve mikrolitre başına 100 pikomolar nihai konsantrasyon elde etmek için hafifçe dönerek karıştırın.
TermoMikserdeki şişeyi 30 ila 40 saniye boyunca 37 santigrat derecede minimum sallama ile inkübe edin. Yanlardaki şişeye hafifçe dokunun ve 15 mikrolitre sgRNA toplamak için şişeyi döndürün. 1 mikrolitrelik alikotlar yapın ve 1 yıla kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Nükleofeksiyon için, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj edilerek 5. hücrelere 2 kez 10. Süpernatant atıldıktan sonra, peleti tamponun 20 mikrolitresinde yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu hazırlanan RNP kompleksi ile hava kabarcıklarını önleyerek yavaşça karıştırın.
Şimdi, süspansiyonu ticari nükleofeksiyon şeridine aktarın ve DZ-100 darbe kodunu seçerek 4D-Nükleofektörü kullanarak hücreleri elektroporat yapın. Nükleofeksiyon şeridindeki elektroporasyonlu hücrelere, 100 mikrolitre önceden inkübe edilmiş kültür ortamı ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Kuluçka sonunda, içeriği deneysel gereksinimlere göre kültür plakasına aktarın.
NSG farelerini HSPC transplantasyonundan 6 ila 8 saat önce pasta kafeslerine yerleştirin. Ticari olarak temin edilebilen bir ışınlayıcı kullanarak fareleri 3,5 gride ışınlayın. NBSGW için, HSPC transplantasyonundan 48 saat önce vücut ağırlığının kilogramı başına 12.5 miligramlık bir dozda intraperitoneal olarak busulfan enjekte ederek 6 ila 8 haftalık erkek ve dişi farelerin ön koşulu.
1 fareyi demlemek için, 5 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj yaparak 1.5 mililitrelik bir tüpte 5. hücrelere 6 kez 10 kez pelet verin. oda sıcaklığında. Peleti rahatsız etmeden süpernatantı nazikçe pipetle çıkarın ve hücre peletini 100 mikrolitre PBS içinde yeniden askıya alın.
Önceden şartlandırılmış NSG veya NBSGW farelerini fare tutucusuna yerleştirin ve HSPC'leri kuyruk damarı enjeksiyonu ile infüze edin. Fare kuyruğunu tutun ve fareyi dizginlemek için fişi hafifçe itin. Fare kuyruğunu% 70 etanol ile nazikçe silin.
31 gauge insülin şırıngası kullanarak, hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini aspire edin. Şimdi, kızılötesi lambadan gelen ışığı 30 ila 40 saniye boyunca kuyruğa yönlendirin ve farenin vücut bölgesini kağıt mendil kıvrımlarıyla kaplayın. Kuyruğu şırınga ile planya ekseninde tutmak için, sol işaret parmağınızla kaldırın.
İğnenin eğim kısmını yavaşça sol veya sağ kaudal kuyruk damarına 20 derecelik bir açıyla yerleştirin. Hücre süspansiyonunu damara demlemek için pistonu itin ve delinmiş bölgenin yakınında doku kağıdı ile hafif basınç uygulayın ve iğneyi çekin. Anestezi uyguladıktan sonra, hayvanı ventral yatışa yerleştirin ve gözü açmak için fareleri nazikçe ovalayın ve gözün küresinin hafifçe çıkıntı yapmasına izin verin.
Mera pipetini 30 ila 45 derecelik bir açıyla nazikçe niktasyon zarının altındaki gözün medial kantusuna yerleştirin. Pasteur pipeti uygun konuma yerleştirdikten sonra, tüpe hafif bir basınç uygulayın ve tüpü yavaşça döndürmeye başlayın. 50 ila 80 mikrolitre periferik kan topladıktan sonra, pipeti gözün medial kanthus bölgesinden yavaşça çekin.
Ötanizasyon sonrası, üretranın 1 santimetre yukarısında dikey bir kesi yapın ve diyaframın 1 santimetre altına kadar uzatın. Karın bölgesini açmak için kesilmiş bölgenin köşelerinde yatay olarak kesin. Femur ve tibiayı diseke ettikten sonra, femur ve tibiaya bağlı yumuşak dokuları çıkarmak için makas kullanın ve kemikleri bir doku kağıdı ile nazikçe ovalayın.
0,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünün dibinde çapı 0,2 santimetreden fazla olmayan küçük bir delik açmak için bir neşter kullanın. Bir neşter kullanarak kemiklerin proksimal uçlarını çıkarın ve kemikleri, kesilen tarafı 0,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünün deliğine bakacak şekilde yerleştirin. Şimdi, 0.5 mililitrelik tüpü kemiklerle birlikte 100 mikrolitre steril PBS içeren 1.5 mililitrelik tüpe yerleştirin.
Kapağı kapatın, tüpleri oda sıcaklığında steril koşullar altında 3 dakika boyunca 200 kez g'de döndürün ve boş bir ilik boşluğuna sahip kemikler içeren 0,5 mililitrelik tüpleri atın. Kemik iliği içeren 1.5 mililitrelik reaksiyon tüpüne, 1 mililitre PBS ekleyin, ardından 1 mililitrelik bir pipet kullanarak, hücreleri 10 kez hafifçe askıya alın. Hücre süspansiyonunun 1 mililitresini, 9 mililitre RBC lizis tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Her iki dakikada bir tüpü hafifçe ters çevirerek hücreleri 7 dakika boyunca buzda inkübe edin. Kuluçkadan sonra, tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj edin ve berrak soluk beyaz bir pelet gözlenene kadar yıkamayı tekrarlayın. Canlı hücrelerin ve CD34-pozitif, CD90-pozitif hücrelerin sıklığı 48 saatlik nükleofeksiyondan sonra RUS grubunda artmıştır.
72 saat sonra, indel yüzdesi ve sıklığı, RUS-tedavi edilen grupta, DMSO ile tedavi edilen gruba kıyasla artmıştır ve gen düzenlemesinde bir artış olduğunu düşündürmektedir. CD34-pozitif, CD90-pozitif hücrelerin ve toplam çekirdekli hücrelerin mutlak sayısı, düzenleme sonrası 48 saat içinde önemli ölçüde daha yüksektir. NSG farelerinde insan CD45-pozitif hücrelerinin akış sitometrisi analizi, kültür koşullarında artmış engraftman göstermiştir.
Fare BM hücrelerindeki gen düzenleme sıklığının analizi, RUS takviyeli kültür koşullarında gen düzenlenmiş HSPC'lerin engraftmanının arttığını göstermiştir. HSPC'lerin mL başına 200.000 hücrenin bir araya geldiği bir yerde kültürlenmesi, fonksiyonel kök hücrelerin iyileştirilmesi için çok önemlidir. Kordon kanı kök hücrelerinin ve iSPC türevi kök hücrelerin çoğaltılması, bu protokolün test edildiği yeni alanlardır.
