La culture ex vivo peut entraver le potentiel de repopulation des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques. Notre protocole préserve la souche pendant la culture et améliore ainsi la fréquence des cellules génétiquement modifiées in vivo. La thérapie génique par cellules souches hématopoïétiques est actuellement utilisée pour les maladies monogéniques et les maladies infectieuses comme le VIH.
Le protocole de thérapie génique HSPC repose fortement sur la culture ex vivo. Notre protocole doit être compatible avec toute procédure utilisant une culture ex vivo. Vigneshwaran Venkatesan, doctorant de mon laboratoire, fera la démonstration de ce protocole.
Après avoir isolé les HSPC, les cultiver dans des milieux de culture de cellules souches contenant des cytokines et de petites molécules Resvératrol, UM729 et StemRegenin1. Avant l’édition génétique, réglez le ThermoMixer à 37 degrés Celsius pour reconstituer l’ARN guide, puis préchauffez le tampon TE à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Centrifuger le flacon d’ARNg synthétique chimiquement modifié à 11 000 fois g pendant 1 minute à 4 degrés Celsius et ajouter 15 microlitres de tampon TE au flacon contenant 1,5 nanomolaire d’ARNg lyophilisé et mélanger par agitation douce pour obtenir une concentration finale de 100 picomolar par microlitre.
Incuber le flacon dans le ThermoMixer avec une agitation minimale à 37 degrés Celsius pendant 30 à 40 secondes. Tapotez doucement le flacon sur les côtés et faites tourner le flacon pour recueillir 15 microlitres d’ARNg. Faites des aliquotes de 1 microlitre et conservez-les à moins 80 degrés Celsius pendant 1 an.
Pour la nucléofection, pelleter 2 fois 10 à la 5ème cellule par centrifugation à 200 fois g pendant 5 minutes à température ambiante. Une fois le surnageant jeté, remettre la pastille en suspension dans 20 microlitres du tampon. Mélangez délicatement la suspension cellulaire avec le complexe RNP préparé en évitant les bulles d’air.
Maintenant, transférez la suspension sur la bande de nucléofection commerciale et électroporez les cellules à l’aide du 4D-Nucleofector en sélectionnant le code d’impulsion DZ-100. Aux cellules électroporées de la bande de nucléofection, ajouter 100 microlitres de milieux de culture pré-incubés et laisser les cellules intactes pendant 10 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, transférer le contenu sur la plaque de culture selon les exigences expérimentales.
Placez les souris NSG dans les cages à tarte 6 à 8 heures avant la transplantation HSPC. Irradier les souris à 3,5 gray à l’aide d’un irradiateur disponible dans le commerce. Pour les NBSGW, préconditionner les souris mâles et femelles âgées de 6 à 8 semaines par injection intrapéritonéale de busulfan à une dose de 12,5 milligrammes par kilogramme de poids corporel 48 heures avant la transplantation HSPC.
Pour infuser 1 souris, granuler 6 fois 10 à la 5ème cellule dans un tube de 1,5 millilitre par centrifugation à 200 fois g pendant 5 minutes. à température ambiante. Extraire doucement le surnageant sans déranger la pastille et remettre en suspension la pastille de cellule dans 100 microlitres de PBS.
Placez les souris NSG ou NBSGW préconditionnées dans le dispositif de retenue de la souris et perfez les HSPC par injection veineuse de la queue. Tenez la queue de la souris et poussez doucement la fiche pour retenir la souris. Essuyez délicatement la queue de la souris avec de l’éthanol à 70%.
À l’aide d’une seringue à insuline de calibre 31, aspirez 100 microlitres de la suspension cellulaire. Maintenant, dirigez la lumière de la lampe infrarouge sur la queue pendant 30 à 40 secondes, couvrant la zone du corps de la souris avec des plis de papier de soie. Pour maintenir la queue dans l’axe de rabotage avec la seringue, soulevez-la avec l’index gauche.
Insérez doucement la partie biseautée de l’aiguille dans la veine caudale gauche ou droite à un angle de 20 degrés. Poussez le piston pour infuser la suspension cellulaire dans la veine et appliquez une légère pression près de la région percée avec du papier de soie et retirez l’aiguille. Après l’anesthésie, placez l’animal en position couchée ventrale et frottez doucement les souris pour ouvrir l’œil, permettant au globe oculaire de dépasser légèrement.
Insérez délicatement la pipette de pâturage à un angle de 30 à 45 degrés dans le canthus médian de l’œil sous la membrane nictante. Après avoir placé la pipette Pasteur dans la bonne position, appliquez une légère pression sur le tube et commencez à le faire tourner doucement. Après avoir recueilli 50 à 80 microlitres de sang périphérique, retirez doucement la pipette du canthus médial de l’œil.
Après l’euthanasie, faites une incision verticale de 1 centimètre au-dessus de l’urètre et étendez-vous jusqu’à 1 centimètre au-dessous du diaphragme. Couper horizontalement aux coins de la zone incisée pour ouvrir la région abdominale. Après avoir disséqué le fémur et le tibia, utilisez des ciseaux pour enlever les tissus mous attachés au fémur et au tibia et frottez doucement les os avec un papier de soie.
Utilisez un scalpel pour faire un petit trou d’un diamètre ne dépassant pas 0,2 centimètre au fond d’un tube microcentrifuge de 0,5 millilitre. Retirez les extrémités proximales des os à l’aide d’un scalpel et placez les os avec le côté coupé vers le trou du tube de microcentrifugation de 0,5 millilitre. Maintenant, placez le tube de 0,5 millilitre avec les os dans le tube de 1,5 millilitre contenant 100 microlitres de PBS stérile.
Fermez le couvercle, faites tourner les tubes à 200 fois g pendant 3 minutes dans des conditions stériles à température ambiante et jetez les tubes de 0,5 millilitre contenant des os avec une cavité moelle vide. Au tube de réaction de 1,5 millilitre contenant de la moelle osseuse, ajouter 1 millilitre de PBS, puis à l’aide d’une pipette de 1 millilitre, remettre doucement les cellules en suspension 10 fois. Transférer 1 millilitre de la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres contenant 9 millilitres de tampon de lyse des globules rouges.
Incuber les cellules dans de la glace pendant 7 minutes en retournant doucement le tube toutes les deux minutes. Après l’incubation, centrifuger le tube à 200 fois g pendant 5 minutes à température ambiante et répéter le lavage jusqu’à ce qu’on observe une pastille blanche pâle claire. La fréquence des cellules vivantes et des cellules CD34-positives, CD90-positives a augmenté dans le groupe RUS après 48 heures de nucléofection.
Après 72 heures, le pourcentage et la fréquence de l’indel ont augmenté dans le groupe traité par RUS par rapport au groupe traité par DMSO, ce qui suggère une augmentation de l’édition de gènes. Le nombre absolu de cellules CD34 positives, CD90 positives et de cellules nucléées totales est significativement plus élevé 48 heures après l’édition. L’analyse par cytométrie en flux de cellules CD45 positives humaines chez les souris NSG a montré une augmentation de la greffe dans les conditions de culture.
L’analyse de la fréquence d’édition de gènes dans les cellules BM de souris a montré une augmentation de la greffe de HSPC génétiquement modifiés dans des conditions de culture supplémentées en RUS. La culture des HSPC à une confluence de 200 000 cellules par mL est cruciale pour améliorer les cellules souches fonctionnelles. L’amplification des cellules souches du sang de cordon ombilical et des cellules souches dérivées de l’iSPC sont les nouveaux domaines dans lesquels ce protocole est testé.
