La coltura ex vivo può ostacolare il potenziale di ripopolamento delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche. Il nostro protocollo preserva la staminalità durante la coltura e quindi migliora la frequenza delle cellule geneticamente modificate in vivo. La terapia genica con cellule staminali ematopoietiche è attualmente impiegata per malattie monogeniche e malattie infettive come l'HIV.
Il protocollo di terapia genica HSPC si basa fortemente sulla coltura ex vivo. Il nostro protocollo dovrebbe essere compatibile con qualsiasi procedura che impieghi la coltura ex vivo. A dimostrare questo protocollo sarà Vigneshwaran Venkatesan, dottorando del mio laboratorio.
Dopo aver isolato gli HSPC, coltivarli in terreni di coltura di cellule staminali che contengono citochine e piccole molecole Resveratrolo, UM729 e StemRegenin1. Prima dell'editing genetico, impostare il ThermoMixer a 37 gradi Celsius per ricostituire l'RNA guida, quindi preriscaldare il tampone TE a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Centrifugare il flaconcino di sgRNA sintetico modificato chimicamente a 11.000 volte g per 1 minuto a 4 gradi Celsius e aggiungere 15 microlitri di tampone TE al flaconcino contenente 1,5 nanomolari di sgRNA liofilizzato e mescolare ruotando delicatamente per ottenere una concentrazione finale di 100 picomolar per microlitro.
Incubare il flaconcino nel ThermoMixer con agitazione minima a 37 gradi Celsius per 30-40 secondi. Picchiettare delicatamente il flaconcino sui lati e ruotare il flaconcino per raccogliere 15 microlitri di sgRNA. Crea aliquote da 1 microlitro e conservale a meno 80 gradi Celsius per un massimo di 1 anno.
Per la nucleofezione, pellet 2 volte 10 alle 5 cellule centrifugando a 200 volte g per 5 minuti a temperatura ambiente. Una volta scartato il surnatante risospendere il pellet in 20 microlitri di tampone. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare con il complesso RNP preparato evitando bolle d'aria.
Ora, trasferire la sospensione alla striscia di nucleofezione commerciale ed elettroporare le cellule usando il 4D-Nucleofector selezionando il codice di impulso DZ-100. Alle cellule elettroporate nella striscia di nucleofezione, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura pre-incubato e lasciare le cellule indisturbate per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, trasferire il contenuto nella piastra di coltura secondo i requisiti sperimentali.
Posizionare i topi NSG nelle gabbie della torta in 6-8 ore prima del trapianto di HSPC. Irradiare i topi a 3,5 gray utilizzando un irradiatore disponibile in commercio. Per NBSGW, pre-condizionare topi maschi e femmine di età compresa tra 6 e 8 settimane iniettando busulfan per via intraperitoneale alla dose di 12,5 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo 48 ore prima del trapianto di HSPC.
Per infondere 1 mouse, pellet 6 volte 10 alle celle 5th in un tubo da 1,5 millilitri centrifugando a 200 volte g per 5 minuti. a temperatura ambiente. Pipettare delicatamente il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di PBS.
Posizionare i topi NSG o NBSGW precondizionati nel sistema di ritenuta del mouse e infondere gli HSPC mediante iniezione di vene caudali. Tenere la coda del mouse e spingere delicatamente la spina per trattenere il mouse. Pulire delicatamente la coda del mouse con etanolo al 70%.
Utilizzando una siringa da insulina da 31 gauge, aspirare 100 microlitri della sospensione cellulare. Ora, dirigi la luce dalla lampada a infrarossi sulla coda per 30-40 secondi, coprendo l'area del corpo del mouse con pieghe di carta velina. Per mantenere la coda nell'asse della pialla con la siringa, sollevarla con l'indice sinistro.
Inserire delicatamente la parte smussata dell'ago nella vena caudale sinistra o destra con un angolo di 20 gradi. Spingere lo stantuffo per infondere la sospensione cellulare nella vena e applicare una leggera pressione vicino alla regione forata con carta velina ed estrarre l'ago. Dopo l'anestetizzazione, posizionare l'animale in posizione ventrale sdraiata e collottolare delicatamente i topi per aprire l'occhio, permettendo al globo dell'occhio di sporgere leggermente.
Inserire delicatamente la pipetta da pascolo con un angolo di 30-45 gradi nel canto mediale dell'occhio sotto la membrana nittante. Dopo aver posizionato la pipetta Pasteur nella posizione corretta, applicare una leggera pressione sul tubo e iniziare a ruotare delicatamente il tubo. Dopo aver raccolto da 50 a 80 microlitri di sangue periferico, ritirare delicatamente la pipetta dal canto mediale dell'occhio.
Dopo l'eutanasia, praticare un'incisione verticale di 1 centimetro sopra l'uretra e allungare fino a 1 centimetro sotto il diaframma. Tagliare orizzontalmente agli angoli della zona incisa per aprire la regione addominale. Dopo aver sezionato il femore e la tibia, utilizzare le forbici per rimuovere i tessuti molli attaccati al femore e alla tibia e strofinare delicatamente le ossa con una carta velina.
Utilizzare un bisturi per fare un piccolo foro con un diametro non superiore a 0,2 centimetri sul fondo di un tubo di microcentrifuga da 0,5 millilitri. Rimuovere le estremità prossimali delle ossa usando un bisturi e posizionare le ossa con il lato tagliato rivolto verso il foro del tubo di microcentrifugazione da 0,5 millilitri. Ora, posizionare il tubo da 0,5 millilitri con le ossa nel tubo da 1,5 millilitri contenente 100 microlitri di PBS sterile.
Chiudere il coperchio, girare i tubi a 200 volte g per 3 minuti in condizioni sterili a temperatura ambiente e scartare i tubi da 0,5 millilitri contenenti ossa con una cavità midollare vuota. Al tubo di reazione da 1,5 millilitri contenente midollo osseo, aggiungere 1 millilitro di PBS, quindi utilizzando una pipetta da 1 millilitro, risospendere delicatamente le cellule 10 volte. Trasferire 1 millilitro della sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri contenente 9 millilitri di tampone per lisi dei globuli rossi.
Incubare le cellule nel ghiaccio per 7 minuti invertendo delicatamente il tubo ogni due minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare il tubo a 200 volte g per 5 minuti a temperatura ambiente e ripetere il lavaggio fino a quando non si osserva un pellet bianco chiaro chiaro. La frequenza delle cellule vive e delle cellule CD34-positive, CD90-positive è aumentata nel gruppo RUS dopo 48 ore di nucleofezione.
Dopo 72 ore, la percentuale e la frequenza di indel sono aumentate nel gruppo trattato con RUS rispetto al gruppo trattato con DMSO, suggerendo un aumento dell'editing genetico. Il numero assoluto di cellule CD34-positive, CD90-positive e cellule nucleate totali è significativamente più alto 48 ore dopo l'editing. L'analisi citometrica a flusso di cellule CD45-positive umane nei topi NSG ha mostrato un aumento dell'attecchimento nelle condizioni di coltura.
L'analisi della frequenza di modifica genetica nelle cellule BM del topo ha mostrato un aumento dell'attecchimento di HSPC geneticamente modificati in condizioni di coltura integrate con RUS. La coltura delle HSPC ad una confluenza di 200.000 cellule per ml è fondamentale per migliorare le cellule staminali funzionali. L'amplificazione delle cellule staminali del sangue del cordone ombelicale e delle cellule staminali derivate da iSPC sono le nuove aree in cui questo protocollo viene testato.
