תרבית Ex vivo יכולה לעכב את פוטנציאל ההתפשטות מחדש של תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים. הפרוטוקול שלנו משמר את הגבעול במהלך התרבית ובכך משפר את התדירות של תאים מהונדסים גנטית in vivo. טיפול גנטי בתאי גזע המטופויאטיים משמש כיום למחלות מונוגניות ומחלות זיהומיות כמו HIV.
פרוטוקול הטיפול הגנטי HSPC מסתמך במידה רבה על תרבית ex vivo. הפרוטוקול שלנו צריך להיות תואם לכל הליך המשתמש בתרבות ex vivo. מי שידגים את הפרוטוקול הזה יהיה ויגנשוואראן ונקאטסאן, דוקטורנט מהמעבדה שלי.
לאחר בידוד תאי ה-HSPCs, תרבו אותם בתרבית תאי גזע המכילה ציטוקינים ומולקולות קטנות רזברטרול, UM729 ו-StemRegenin1. לפני עריכת גנים, הגדר את ה- ThermoMixer ב- 37 מעלות צלזיוס כדי לשחזר את הרנ"א המנחה, ולאחר מכן לחמם מראש את חיץ TE ב- 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צנטריפוגה של בקבוקון sgRNA סינתטי שעבר שינוי כימי ב 11, 000 פעמים גרם במשך דקה אחת ב 4 מעלות צלזיוס ולהוסיף 15 microliters של חיץ TE לבקבוקון המכיל 1.5 ננומולר של sgRNA lyophilized ומערבבים על ידי מערבולת עדינה כדי לקבל ריכוז סופי של 100 picomolar לכל מיקרוליטר.
יש לדגור על הבקבוקון ב-ThermoMixer עם ניעור מינימלי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 40 שניות. הקישו בעדינות על הבקבוקון בצדדים וסובבו את הבקבוקון כדי לאסוף 15 מיקרוליטרים של sgRNA. הפוך 1-microliter aliquots ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס עד 1 שנה.
עבור נוקלאופקציה, גלולה 2 פעמים 10 לתאים 5 על ידי צנטריפוגה ב 200 פעמים גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הסופר-נטאנט, יש לתלות את הכדור ב-20 מיקרוליטרים של החיץ. ערבבו בעדינות את מתלה התא עם קומפלקס ה-RNP המוכן תוך הימנעות מבועות אוויר.
כעת, העבר את ההשעיה לרצועת הנוקלאופקציה המסחרית וחשמל את התאים באמצעות 4D-Nucleofector על ידי בחירת קוד הדופק DZ-100. לתאים האלקטרופואטים ברצועת הנוקלאופקציה, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מדיית תרבית מודגרת מראש והשאירו את התאים ללא הפרעה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה מעבירים את התכולה לצלחת התרבית בהתאם לדרישות הניסוי.
הניחו את עכברי ה-NSG בכלובי הפאי 6 עד 8 שעות לפני השתלת HSPC. הקרן את העכברים בעוצמה של 3.5 אפור באמצעות הקרנה מסחרית. עבור NBSGW, מצב מקדים של עכברים זכרים ונקבות בני 6 עד 8 שבועות על ידי הזרקה תוך-צפקית של בוסולפן במינון של 12.5 מיליגרם לק"ג משקל גוף 48 שעות לפני השתלת HSPC.
להשראת עכבר אחד, גלולה 6 פעמים 10 לתאים ה -5 בצינור 1.5 מיליליטר על ידי צנטריפוגה ב 200 פעמים גרם במשך 5 דקות. בטמפרטורת החדר. הוציאו בעדינות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור והחזירו את כדור התא ב-100 מיקרוליטרים של PBS.
הנח את עכברי NSG או NBSGW המותנים מראש במרסנת העכבר והחדירו את ה- HSPCs על ידי הזרקת וריד זנב. החזק את זנב העכבר ודחף בעדינות את התקע כדי לרסן את העכבר. נגבו בעדינות את זנב העכבר עם 70% אתנול.
באמצעות מזרק אינסולין 31 מד, לשאוף 100 microliters של ההשעיה התא. כעת, כוון את האור ממנורת האינפרא אדום אל הזנב למשך 30 עד 40 שניות, וכיסה את אזור הגוף של העכבר בקפלי נייר טישו. כדי לשמור על הזנב בציר הפלנר עם המזרק, הרם אותו עם האצבע המורה השמאלית.
הכנס בעדינות את החלק המשופע של המחט לתוך וריד הזנב השמאלי או הימני בזווית של 20 מעלות. לדחוף את הבוכנה כדי להחדיר את ההשעיה התא לתוך הווריד ולהפעיל לחץ עדין ליד האזור מנוקב עם נייר טישו ולשלוף את המחט. לאחר ההרדמה, מקם את החיה בשכיבה גחונית ושפשף בעדינות את העכברים כדי לפתוח את העין, מה שמאפשר לכדור הארץ של העין לבלוט מעט.
מכניסים בעדינות את פיפטה המרעה בזווית של 30 עד 45 מעלות לתוך הקנטוס המדיאלי של העין מתחת לקרום הניקטינג. לאחר הצבת פיפטה פסטר במיקום הנכון, הפעל לחץ קל על הצינור והתחל לסובב את הצינור בעדינות. לאחר איסוף 50 עד 80 microliters של דם היקפי, בעדינות למשוך את פיפטה מן canthus המדיאלי של העין.
לאחר המתת חסד, לבצע חתך אנכי 1 ס"מ מעל השופכה ולהאריך עד 1 ס"מ מתחת לסרעפת. חותכים אופקית בפינות האזור המשופע כדי לפתוח את אזור הבטן. לאחר כריתת עצם הירך והשוקה, השתמשו במספריים כדי להסיר את הרקמות הרכות המחוברות לעצם הירך ולטיביה ושפשפו בעדינות את העצמות בעזרת נייר טישו.
השתמש באזמל כדי ליצור חור קטן בקוטר שאינו עולה על 0.2 ס"מ בתחתית צינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מיליליטר. הסר את הקצוות הפרוקסימליים של העצמות באמצעות אזמל והנח את העצמות כאשר הצד החתך פונה לכיוון החור של צינור הצנטריפוגה המיקרו 0.5 מיליליטר. כעת, הניחו את צינור ה-0.5 מיליליטר עם העצמות בצינור ה-1.5 מיליליטר המכיל 100 מיקרוליטר של PBS סטרילי.
סוגרים את המכסה, מסובבים את הצינורות ב-200 פעמים גרם למשך 3 דקות בתנאים סטריליים בטמפרטורת החדר ומשליכים את צינורות ה-0.5 מיליליטר המכילים עצמות עם חלל מח ריק. לצינור התגובה של 1.5 מיליליטר המכיל מח עצם, הוסף 1 מיליליטר של PBS, ולאחר מכן באמצעות פיפטה של 1 מיליליטר, השהה בעדינות את התאים 10 פעמים. העבר 1 מיליליטר של מתלה התא לצינור 15 מיליליטר המכיל 9 מיליליטר של חיץ ליזה RBC.
דגירה של התאים בקרח למשך 7 דקות על ידי היפוך עדין של הצינור כל שתי דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הצינור ב 200 פעמים גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולחזור על הכביסה עד כדור לבן בהיר ברור הוא ציין. התדירות של תאים חיים ותאים חיוביים ל-CD34, חיוביים ל-CD90, עלתה בקבוצת ה-RUS לאחר 48 שעות של נוקלאופקציה.
לאחר 72 שעות, אחוז ותדירות האינדל עלו בקבוצה שטופלה ב-RUS בהשוואה לקבוצה שטופלה ב-DMSO, מה שמרמז על עלייה בעריכת גנים. המספר האבסולוטי של תאים חיוביים ל-CD34, תאים חיוביים ל-CD90 ותאים בעלי גרעין כולל גבוה משמעותית 48 שעות לאחר העריכה. ניתוח ציטומטריה של זרימה של תאים חיוביים ל-CD45 אנושיים בעכברי NSG הראה השתלה מוגברת בתנאי התרבית.
ניתוח של תדירות עריכת הגנים בתאי ה-BM של העכבר הראה חריטה מוגברת של HSPCs שעברו עריכה גנטית בתנאי תרבית של תוספי RUS. גידול ה-HSPCs במפגש של 200, 000 תאים למ"ל הוא חיוני לשיפור תאי הגזע המתפקדים. הגברת תאי הגזע של הדם הטבורי ותאי הגזע שמקורם ב-iSPC הם התחומים החדשים שבהם פרוטוקול זה נבדק.
