A cultura ex vivo pode dificultar o potencial de repovoamento de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras. Nosso protocolo preserva a caule durante a cultura e, assim, melhora a frequência de células modificadas por genes in vivo. A terapia genética com células-tronco hematopoiéticas está sendo empregada atualmente para doenças monogênicas e doenças infecciosas como o HIV.
O protocolo de terapia gênica do HSPC depende fortemente da cultura ex vivo. Nosso protocolo deve ser compatível com qualquer procedimento que empregue cultura ex vivo. Demonstrando este protocolo estará Vigneshwaran Venkatesan, estudante de doutorado do meu laboratório.
Após o isolamento dos HSPCs, cultivá-los em meios de cultura de células-tronco que contenham citocinas e pequenas moléculas Resveratrol, UM729 e StemRegenin1. Antes da edição do gene, ajuste o ThermoMixer a 37 graus Celsius para reconstituir o RNA guia e, em seguida, pré-aqueça o tampão TE a 37 graus Celsius por 10 minutos. Centrifugar o frasco de sgRNA sintético quimicamente modificado a 11.000 vezes g durante 1 minuto a 4 graus Celsius e adicionar 15 microlitros de tampão TE ao frasco para injetáveis contendo 1,5 nanomolar de sgRNA liofilizado e misturar por rodopio suave para obter uma concentração final de 100 picomolares por microlitro.
Incubar o frasco para injetáveis na BimMisturador com agitação mínima a 37 graus Celsius durante 30 a 40 segundos. Bata suavemente no frasco para injetáveis nas laterais e gire o frasco para injetáveis para recolher 15 microlitros de sgRNA. Faça alíquotas de 1 microlitro e armazene-as a menos 80 graus Celsius por até 1 ano.
Para nucleofecção, pellet 2 vezes 10 para as 5ª células, centrifugando a 200 vezes g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Uma vez que o sobrenadante é descartado, ressuspenda o pellet em 20 microlitros do buffer. Misture suavemente a suspensão celular com o complexo RNP preparado evitando bolhas de ar.
Agora, transfira a suspensão para a tira de nucleofeção comercial e eletroporate as células usando o 4D-Nucleofector selecionando o código de pulso DZ-100. Às células eletroporosas na tira de nucleofeção, adicione 100 microlitros de meio de cultura pré-incubado e deixe as células intactas por 10 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, transfira o conteúdo para a placa de cultura de acordo com os requisitos experimentais.
Coloque os camundongos NSG nas gaiolas de torta em 6 a 8 horas antes do transplante de HSPC. Irradie os ratos a 3,5 de cinza usando um irradiador comercialmente disponível. Para NBSGW, pré-condicionar camundongos machos e fêmeas de 6 a 8 semanas de idade injetando bussulfano por via intraperitoneal na dose de 12,5 miligramas por quilograma de peso corporal 48 horas antes do transplante de HSPC.
Para a infusão de 1 rato, pellet 6 vezes 10 para as 5 células em um tubo de 1,5 mililitro por centrifugação a 200 vezes g por 5 minutos. à temperatura ambiente. Pipete suavemente o sobrenadante sem perturbar o pellet e ressuspenda o pellet celular em 100 microlitros de PBS.
Coloque os ratos NSG ou NBSGW pré-condicionados na contenção do rato e infunda os HSPCs por injeção na veia da cauda. Segure a cauda do mouse e pressione suavemente o plugue para conter o mouse. Limpe suavemente a cauda do rato com etanol a 70%.
Usando uma seringa de insulina de calibre 31, aspirar 100 microlitros da suspensão celular. Agora, direcione a luz da lâmpada infravermelha para a cauda por 30 a 40 segundos, cobrindo a área do corpo do mouse com dobras de papel de seda. Para manter a cauda no eixo da plaina com a seringa, levante-a com o dedo indicador esquerdo.
Insira suavemente a parte chanfrada da agulha na veia caudal esquerda ou direita em um ângulo de 20 graus. Empurre o êmbolo para infundir a suspensão celular na veia e aplique uma pressão suave perto da região perfurada com papel de seda e retire a agulha. Após anestesiar, posicione o animal em decúbito ventral e scruff suavemente os ratos para abrir o olho, permitindo que o globo do olho se projete ligeiramente.
Insira suavemente a pipeta de pastagem em um ângulo de 30 a 45 graus no canto medial do olho sob a membrana nictante. Depois de colocar a pipeta Pasteur na posição correta, aplique uma leve pressão no tubo e comece a girar o tubo suavemente. Depois de coletar 50 a 80 microlitros de sangue periférico, retire suavemente a pipeta do canto medial do olho.
Após a eutanásia, faça uma incisão vertical 1 centímetro acima da uretra e estenda até 1 centímetro abaixo do diafragma. Corte horizontalmente nos cantos da área incisada para abrir a região abdominal. Depois de dissecar o fêmur e a tíbia, use uma tesoura para remover os tecidos moles ligados ao fêmur e à tíbia e esfregue suavemente os ossos com um papel de seda.
Use um bisturi para fazer um pequeno orifício com um diâmetro não superior a 0,2 centímetros na parte inferior de um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro. Remova as extremidades proximais dos ossos usando um bisturi e coloque os ossos com o lado cortado voltado para o orifício do tubo de microcentrifugação de 0,5 mililitro. Agora, coloque o tubo de 0,5 mililitro com os ossos no tubo de 1,5 mililitro contendo 100 microlitros de PBS estéril.
Feche a tampa, gire os tubos a 200 vezes g durante 3 minutos em condições estéreis à temperatura ambiente e descarte os tubos de 0,5 mililitros que contenham ossos com uma cavidade de medula vazia. Para o tubo de reação de 1,5 mililitro contendo medula óssea, adicione 1 mililitro de PBS, em seguida, usando uma pipeta de 1 mililitro, ressuspenda suavemente as células 10 vezes. Transfira 1 mililitro da suspensão celular para um tubo de 15 mililitros contendo 9 mililitros de tampão de lise RBC.
Incubar as células no gelo por 7 minutos, invertendo suavemente o tubo a cada dois minutos. Após a incubação, centrifugar o tubo a 200 vezes g durante 5 minutos à temperatura ambiente e repetir a lavagem até se observar um pellet branco pálido claro. A frequência de células vivas e CD34-positivas, CD90-positivas aumentaram no grupo RUS após 48 horas de nucleofecção.
Após 72 horas, a porcentagem e a frequência de indel aumentaram no grupo tratado com RUS, em comparação com o grupo tratado com DMSO, sugerindo um aumento na edição de genes. O número absoluto de células CD34-positivas, CD90-positivas e células nucleadas totais são significativamente maiores 48 horas após a edição. A análise por citometria de fluxo de células CD45-positivas humanas nos camundongos NSG mostrou aumento do enxerto nas condições de cultura.
A análise da frequência de edição de genes nas células BM de camundongos mostrou aumento do enxerto de HSPCs editados por genes em condições de cultura suplementadas por RUS. Cultivar os HSPCs a uma confluência de 200.000 células por mL é crucial para melhorar as células-tronco funcionais. A amplificação das células estaminais do sangue do cordão umbilical e das células estaminais derivadas do iSPC são as novas áreas em que este protocolo está a ser testado.
