Культура ex vivo может препятствовать репопуляционному потенциалу гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников. Наш протокол сохраняет стволовость во время культуры и, таким образом, улучшает частоту генно-модифицированных клеток in vivo. Генная терапия гемопоэтическими стволовыми клетками в настоящее время используется для моногенных заболеваний и инфекционных заболеваний, таких как ВИЧ.
Протокол генной терапии HSPC в значительной степени опирается на культуру ex vivo. Наш протокол должен быть совместим с любой процедурой, использующей культуру ex vivo. Демонстрировать этот протокол будет Виннешваран Венкатесан, аспирант из моей лаборатории.
После выделения HSPC культивируйте их в культуральной среде стволовых клеток, которая содержит цитокины и небольшие молекулы Resveratrol, UM729 и StemRegenin1. Перед редактированием генов установите ThermoMixer на 37 градусов цельсия, чтобы восстановить направляющую РНК, а затем предварительно разогрейте буфер TE при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. Центрифугируйте синтетический химически модифицированный флакон sgRNA в 11 000 раз г в течение 1 минуты при 4 градусах Цельсия и добавьте 15 микролитров буфера TE во флакон, содержащий 1,5 наномоляра лиофилизированной сгРНК, и перемешайте путем осторожного закручивания, чтобы получить конечную концентрацию 100 пикомоляров на микролитр.
Инкубируйте флакон в ThermoMixer с минимальным встряхиванием при 37 градусах Цельсия в течение 30-40 секунд. Осторожно постучите по флакону по бокам и вращайте флакон, чтобы собрать 15 микролитров сгРНК. Сделайте 1-микролитровые аликвоты и храните их при минус 80 градусах Цельсия до 1 года.
Для нуклеофекции гранулируют 2 раза по 10 - 5-ю клетки центрифугированием в 200 раз в г в течение 5 мин при комнатной температуре. Как только супернатант будет выброшен, повторно суспендируйте гранулу в 20 микролитрах буфера. Аккуратно смешайте клеточную суспензию с подготовленным комплексом RNP, избегая пузырьков воздуха.
Теперь перенесите суспензию на коммерческую нуклеофекционную полосу и электропорируйте ячейки с помощью 4D-нуклеофектора, выбрав импульсный код DZ-100. К электропорированным клеткам в нуклеофекционной полосе добавляют 100 микролитров предварительно инкубированной культуральной среды и оставляют клетки нетронутыми в течение 10 минут при комнатной температуре. В конце инкубации перенесите содержимое на культуральную пластину в соответствии с экспериментальными требованиями.
Поместите мышей NSG в клетки для пирогов за 6-8 часов до трансплантации HSPC. Облучайте мышей в 3,5 грея с помощью коммерчески доступного облучателя. Для NBSGW предварительное условие от 6 до 8-недельных самцов и самок мышей путем внутрибрюшинного введения бусульфана в дозе 12,5 миллиграммов на килограмм массы тела за 48 часов до трансплантации HSPC.
Для инфузии 1 мыши гранулируют 6 раз по 10 до 5-й клетки в 1,5-миллилитровую пробирку путем центрифугирования по 200 раз в г в течение 5 мин. при комнатной температуре. Аккуратно выложите супернатант, не нарушая гранулу, и повторно суспендируйте гранулу ячейки в 100 микролитрах PBS.
Поместите предварительно кондиционированных мышей NSG или NBSGW в мышиный ограничитель и вливайте HSPC путем инъекции в хвостовую вену. Удерживайте хвост мыши и осторожно нажмите на вилку, чтобы удерживать мышь. Аккуратно протрите хвост мыши 70% этанолом.
Используя инсулиновый шприц 31 калибра, аспирируют 100 микролитров клеточной суспензии. Теперь направляйте свет от инфракрасной лампы на хвост в течение 30-40 секунд, покрывая область тела мыши складками папиросной бумаги. Чтобы удержать хвост в оси строгального станка шприцем, поднимите его указательным пальцем левой руки.
Аккуратно вставьте коническую часть иглы в левую или правую хвостовую вену под углом 20 градусов. Надавите на плунжер, чтобы влить клеточную суспензию в вену и нанесите мягкое давление на проколотую область папиросной бумагой и вытащите иглу. После обезболивания поместите животное в вентральное лежачее состояние и осторожно зажмите мышей, чтобы открыть глаз, позволяя глобусу глаза слегка выступать.
Аккуратно вставьте пастбищную пипетку под углом от 30 до 45 градусов в медиальный кантус глаза под мигательную мембрану. Поместив пипетку Пастера в нужное положение, приложите небольшое давление к трубке и начните осторожно вращать трубку. После сбора от 50 до 80 микролитров периферической крови осторожно извлеките пипетку из медиального кантуса глаза.
После эвтаназии сделайте вертикальный разрез на 1 сантиметр выше уретры и вытяните до 1 сантиметра ниже диафрагмы. Вырежьте горизонтально по углам разрезанной области, чтобы открыть брюшную область. После рассечения бедренной и большеберцовой костей используйте ножницы для удаления мягких тканей, прикрепленных к бедренной и большеберцовой кости, и аккуратно очистите кости папиросной бумагой.
С помощью скальпеля сделать небольшое отверстие диаметром не более 0,2 сантиметра на дне 0,5-миллилитровой микроцентрифужной трубки. Удалите проксимальные концы костей с помощью скальпеля и поместите кости разрезанной стороной лицом к отверстию 0,5-миллилитровой микроцентрифугирующей трубки. Теперь поместите 0,5-миллилитровую трубку с костями в 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 100 микролитров стерильного PBS.
Закройте крышку, раскрутите трубки по 200 раз в течение 3 минут в стерильных условиях при комнатной температуре и выбросьте 0,5-миллилитровые трубки, содержащие кости с пустой полостью костного мозга. К 1,5-миллилитровой реакционной трубке, содержащей костный мозг, добавляют 1 миллилитр PBS, затем, используя 1-миллилитровую пипетку, осторожно повторно суспендируют клетки 10 раз. Переложите 1 миллилитр клеточной суспензии в 15-миллилитровую трубку, содержащую 9 миллилитров буфера лизиса эритроцитов.
Инкубируйте клетки во льду в течение 7 минут, осторожно переворачивая трубку каждые две минуты. После инкубации центрифугируют пробирку в 200 раз в г в течение 5 минут при комнатной температуре и повторяют промывку до тех пор, пока не будет наблюдаться прозрачная бледно-белая гранула. Частота живых клеток и CD34-положительных, CD90-положительных клеток увеличилась в группе RUS после 48 часов нуклеофекции.
Через 72 часа процент и частота инделов увеличились в группе, получавшей RUS, по сравнению с группой, получавшей ДМСО, что свидетельствует об увеличении редактирования генов. Абсолютное число CD34-положительных, CD90-положительных клеток и общих ядерных клеток значительно выше через 48 часов после редактирования. Анализ проточной цитометрии CD45-положительных клеток человека у мышей NSG показал повышенное приживление в условиях культивирования.
Анализ частоты редактирования генов в клетках BM мышей показал повышенное приживление генетически отредактированных HSPC в условиях культуры, дополненной RUS. Культивирование HSPC при слиянии 200 000 клеток на мл имеет решающее значение для улучшения функциональных стволовых клеток. Амплифицирование стволовых клеток пуповинной крови и стволовых клеток, полученных из iSPC, являются новыми областями, в которых этот протокол тестируется.
