تطبيق Lucifer Yellow على وسائط enteroids القمي يوفر طريقة بسيطة للتحليل الكمي والنوعي لجميع مسارات نفاذية الأمعاء الرئيسية الثلاثة في نموذج 3D. إنها تقنية مباشرة نسبيا تسمح لنا بتقييم النفاذية باستخدام نموذج معوي. نحن نعمل مع هذه التقنية في دراستنا لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر.
ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة في دراسة أي مرض معوي بشري ، باستخدام نموذج معوي. سيتم توضيح الإجراءات اليوم من قبل علماء أبحاث ما بعد الدكتوراه لدينا ، الدكتور تايلر ليفا ، والدكتورة ألينا جولوبكوفا ، بالإضافة إلى كاميل شليغل ، مساعد مشرف الأبحاث من مختبرنا. للبدء ، قم بتنمية أجهزة Android المضمنة في BMM لمدة سبعة إلى 10 أيام باستخدام وسائط مكيفة بنسبة 50٪ LWRN لتوليد المعوي القمي أو AO.
قم بإزالة الوسائط من حول قباب BMM وأضف 500 ميكرولتر من محلول استعادة الخلايا ، أو CRS إلى بئر واحد. كشط القبة ، ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لتجانس CRS مع المعويات المضمنة في قباب BMM ، وإضافة هذا الحل إلى البئر التالي. مرة أخرى ، اكشط القبة وماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات قبل نقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.
أضف 500 ميكرولتر من CRS إلى البئر الثاني ، ماصة لأعلى ولأسفل لخلطها جيدا ونقلها إلى البئر الأول. من البئر الأول ، قم بتجميع محلول CRS enteroid BMM في نفس أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملليلتر وكرر هذا التجميع للآبار المتبقية حتى تصبح محتويات جميع الآبار في CRS. ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على محلول CRS المجمع على دوار لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية.
ثم قم بالطرد المركزي لأنبوب الطرد المركزي الدقيق عند 200 × جم لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية قبل إزالة المادة الطافية ، وإعادة تعليق الحبيبات المعوية في ملليلتر واحد من الوسائط المكيفة بنسبة 50٪ LWRN. انقل برفق 500 ميكرولتر من محلول الأمعاء أو الوسائط المعاد تعليقه إلى كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة ذات التعلق المنخفض للغاية 24 جيدا. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 ، لمدة ثلاثة أيام قبل التجربة.
تأكد من تعليق المعويات AO لمدة 72 ساعة على الأقل قبل الاستخدام. انقل برفق جميع المعويات المعلقة في الوسائط من كل بئر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة المادة الطافية.
أضف 10 ميكرولتر من خمسة ملليغرام لكل ملليلتر من عديد السكاريد الدهني ، أو LPS إلى 500 ميكرولتر من 50٪ وسائط مكيفة LWRN لكل بئر لتحضير المزيج الرئيسي ، وأعد تعليق حبيبات AO المعوية من مجموعة المعالجة إلى 500 ميكرولتر من LPS بالإضافة إلى 50٪ وسائط مكيفة LWRN. ماصة صعودا وهبوطا لخلط جيدا. حصة 500 ميكرولتر من التعليق في كل بئر من لوحة ربط منخفضة للغاية 24 بئر.
وبالمثل ، أعد تعليق المعويات AO من مجموعة التحكم غير المعالجة في 500 ميكرولتر من 50٪ وسائط مكيفة LWRN لكل بئر وحصة 500 ميكرولتر من هذا التعليق في كل بئر من لوحة ربط منفصلة 24 بئرا منخفضة للغاية. تحفيز نقص الأكسجة في LPS المعالج AO enteroids باستخدام غرفة حاضنة معيارية مع 1٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 94٪ نيتروجين ، واحتضان المعويات مع نقص الأكسجة و LPS لمدة 24 ساعة. ضع الثقافات غير المعالجة و LPS بالإضافة إلى نقص الأكسجة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة 24 ساعة.
لقياس نفاذية الخلايا باستخدام Lucifer Yellow أو LY ، قم بنقل التعليق المعوي أو الوسيط برفق من كل بئر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. محلول ملحي دافئ من فوسفات Dulbecco أو DPBS ، ووسائط مكيفة بنسبة 50٪ LWRN في حمام مائي 37 درجة مئوية. جهاز طرد مركزي التعليق عند 300 × جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
قم بإزالة الوسائط ، واغسل الحبيبات المعوية ب 500 ميكرولتر من DPBS الدافئ قبل الطرد المركزي عند 300 X g لمدة ثلاث دقائق. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة صغيرة وكرر خطوة غسل DPBS مرة أخرى. بعد غسل DPBS ، أضف 450 ميكرولتر من الوسائط المكيفة الدافئة بنسبة 50٪ LWRN ، وأضف التعليق إلى لوحة بئر 24.
ثم أضف 50 ميكرولتر من 2.5 ملليغرام لكل ملليلتر LY إلى كل بئر. حرك الطبق برفق حتى يمتزج ، وضعه في حاضنة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين. ماصة برفق تعليق المعوي من كل بئر في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
الطرد المركزي عليه وإزالة طافت ترك بيليه المعوية وراءها. اغسل الحبيبات باستخدام 500 ميكرولتر من DPBS الدافئ وجهاز الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية تاركة الحبيبات خلفها.
كرر ثلاث غسلات من DPBS قبل إعادة تعليق الحبيبات ب 1000 ميكرولتر من DPBS البارد ، وافصل المعويات عن طريق الخلط القوي باستخدام ماصة. بالنسبة لمنحنى Lucifer Yellow القياسي ، قم بإعداد المعايير المخففة في DPBS كما هو موضح في النص. ماصة 150 ميكرولتر من كل عينة لكل بئر في ثلاث نسخ على لوحة بئر 96.
قم بقياس التألق عند ذروة إثارة تبلغ 428 نانومتر وذروة انبعاث تبلغ 536 نانومتر على قارئ لوحة مضان. احسب التركيزات باستخدام البرامج الإحصائية ومنحنى رباعي المعلمات لاستيفاء المنحنى القياسي. أظهر تلطيخ الفلورسنت المناعي للمعوية المعلقة في وسائط LWRN بنسبة 50٪ لمدة 72 ساعة Zo-1 على السطح القمي الخارجي للمعوي ، بينما شوهد بيتا كاتينين على السطح القاعدي.
وأشار إلى انعكاس القطبية المتوقع للمعوية مما يؤكد تشكيل AO للمعوية. أظهرت المعوية القاعدية ، أو BO المعوية المعالجة ب LPS ونقص الأكسجة زيادة ملحوظة في النفاذية التي تم إثباتها في مقايسة Lucifer Yellow أو LY من خلال زيادة امتصاص صبغة LY في التجويف المعوي ، مقارنة بالضوابط غير المعالجة. أظهر اختبار Lucifer Yellow أيضا زيادة امتصاص LY في تجويف المعويات AO المعالجة مقارنة بالضوابط غير المعالجة.
وأكد زيادة نفاذية المعوية AO المعالجة ب LPS ونقص الأكسجة ، مقارنة بالضوابط غير المعالجة. من المهم غسل الكريات المعوية جيدا لضمان إزالة كل LY الخارجي. يسمح بالتحديد الكمي الدقيق ل LY داخل اللمعة المتبقية في حساب النفاذية.
للتحليل النوعي ، يمكن تصور المعوية عبر الفحص المجهري الفلوري لامتصاص LY في التجويف. بعد حضانة LY وخطوات الغسيل اللاحقة قبل الانفصال عن قراءة الصفيحة الدقيقة.
