ルシファーイエローを頂端エンテロイドの培地に適用することで、3Dモデルで3つの主要な傍細胞腸透過性経路すべてを定量的および定性的に分析するための簡単な方法が提供されます。これは比較的簡単な手法であり、腸内モデルを使用して透過性を評価することができます。私たちは壊死性腸炎の研究にこの技術を使用しています。
しかしながら、この技術は、腸管モデルを利用して、あらゆるヒト腸疾患の研究において有用であり得る。今日の手順のデモンストレーションは、ポスドク研究員のタイラー・レイバ博士とアレナ・ゴルブコワ博士、そして私たちの研究室の研究助手であるカミーユ・シュレーゲルです。まず、BMMに埋め込まれたアンドロイドを、頂端またはAO腸管生成用の50%LWRN馴化培地で7〜10日間成長させます。
BMMドームの周囲から培地を取り出し、500マイクロリットルの細胞回収溶液またはCRSを1つのウェルに追加します。ドームをこすり、上下に数回ピペットで動かして、BMMドームに埋め込まれたエンテロイドでCRSを均質化し、この溶液を次のウェルに追加します。繰り返しになりますが、ドームをこすり、ピペットで数回上下に動かしてから、溶液をマイクロ遠心チューブに移します。
500マイクロリットルのCRSを2番目のウェルに加え、ピペットを上下に動かしてよく混合し、最初のウェルに移します。最初のウェルから、CRS腸内BMM溶液を同じ1.5ミリリットルの微量遠心チューブにプールし、すべてのウェルの内容物がCRSになるまで残りのウェルに対してこのプールを繰り返します。プールされたCRS溶液を含むマイクロ遠心チューブをローテーターに摂氏4度で1時間置きます。
次に、上清を除去する前に、マイクロ遠心チューブを摂氏4度で200 X gで3分間遠心分離し、腸管ペレットを1ミリリットルの50%LWRN馴化培地に再懸濁します。再懸濁した腸管または培地溶液500マイクロリットルを超低付着24ウェル組織培養プレートの各ウェルに静かに移す。実験の前に、プレートを摂氏37度で5%CO2で3日間インキュベートします。
使用前にAOエンテロイドが少なくとも72時間中断されていることを確認してください。培地に懸濁したすべてのエンテロイドを各ウェルからマイクロ遠心チューブに静かに移します。室温で300 X gで3分間遠心分離し、上清を除去します。
リポ多糖1ミリリットルあたり5ミリグラムの10マイクロリットル、またはLPSをウェルあたり500マイクロリットルの50%LWRN馴化培地に加えてマスターミックスを調製し、治療群のAOエンテロイドペレットを500マイクロリットルのLPSと50%LWRN馴化培地に再懸濁します。ピペットを上下に動かして完全に混ぜます。500マイクロリットルの懸濁液を24ウェル超低アタッチメントプレートの各ウェルに分注します。
同様に、未処理対照群からのAOエンテロイドをウェル当たり500マイクロリットルの50%LWRN馴化培地に再懸濁し、この懸濁液500マイクロリットルを別個の24ウェル超低付着プレートの各ウェルに分注する。1%酸素、5%二酸化炭素、および94%窒素を備えたモジュラーインキュベーターチャンバーを使用してLPS処理AOエンテロイドに低酸素を誘発し、低酸素およびLPSで24時間インキュベートします。未処理およびLPSと低酸素処理の培養物を5%二酸化炭素インキュベーターに24時間入れます。
ルシファーイエローまたはLYを使用して傍細胞透過性を測定するには、腸管または培地懸濁液を各ウェルから微量遠心チューブに静かに移します。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水またはDPBS、および50%LWRN馴化培地を摂氏37度の水浴中で温めます。懸濁液を300 X gで室温で3分間遠心分離します。
培地を取り出し、腸内ペレットを500マイクロリットルの温かいDPBSで洗浄してから、300 X gで3分間遠心分離します。マイクロピペットで上清を取り除き、DPBS洗浄ステップをもう一度繰り返します。DPBS洗浄後、450マイクロリットルの温かい50%LWRNコンディショニング培地を加え、懸濁液を24ウェルプレートに加えます。
次に、各ウェルに50マイクロリットルの2.5ミリグラム/ミリリットルLYを追加します。プレートを穏やかに回転させて混合し、5%二酸化炭素インキュベーターに2時間置きます。各ウェルから腸管懸濁液をマイクロ遠心チューブに静かにピペットで入れます。
それを遠心分離し、腸内ペレットを残して上清を取り除きます。500マイクロリットルの温かいDPBSを使用してペレットを洗浄し、遠心分離します。ペレットを残して上清を取り除きます。
ペレットを1000マイクロリットルの冷たいDPBSで再懸濁する前に、DPBSの洗浄を3回繰り返し、ピペットを使用して激しく混合してエンテロイドを解離します。ルシファーイエローの検量線については、本文の説明に従ってDPBSで希釈した標準を準備します。各サンプル150マイクロリットルを96ウェルプレート上で3連で1ウェルにピペットする。
蛍光プレートリーダーで428ナノメートルの励起ピークと536ナノメートルの発光ピークの蛍光を測定します。統計ソフトウェアと検量線を補間する4つのパラメータ曲線を使用して濃度を計算します。50%LWRN培地に懸濁したエンテロイドを72時間免疫蛍光染色したところ、エンテロイドの外側頂端表面にZo-1が見られ、基底外側表面にベータカテニンが見られました。
これは、エンテロイドのAO立体配座を確認するエンテロイドの予想される極性反転を示した。LPSおよび低酸素で処理された基底外側アウト、またはBOエンテロイドは、未処理の対照と比較して、腸内腔へのLY色素の取り込みの増加によってルシファーイエローまたはLYアッセイで実証された有意な透過性の増加を示しました。Lucifer Yellowアッセイはまた、未処理の対照と比較して、処理されたAOエンテロイドの内腔におけるLYの取り込みの増加を示しました。
LPSおよび低酸素で処理されたAOエンテロイドの透過性の増加を、未処理の対照と比較して確認した。腸内ペレットを徹底的に洗浄して、すべての管腔外LYを確実に除去することが重要です。これにより、透過性を計算する際に残っている管腔内LYを正確に定量化できます。
定性分析のために、エンテロイドを蛍光顕微鏡で可視化し、内腔へのLY取り込みを行うことができます。LYインキュベーションとその後の洗浄ステップを経て、マイクロプレートの読み取りから解離します。
