L'applicazione di Lucifer Yellow ai terreni di enteroidi Apical-out fornisce un metodo semplice per l'analisi quantitativa e qualitativa di tutte e tre le principali vie di permeabilità intestinale paracellulare in un modello 3D. È una tecnica relativamente semplice che ci consente di valutare la permeabilità utilizzando un modello enteroide. Stiamo lavorando con questa tecnica nei nostri studi sull'enterocolite necrotizzante.
Tuttavia, questa tecnica può essere utile nello studio di qualsiasi malattia intestinale umana, utilizzando un modello enteroide. A dimostrare le procedure oggi saranno i nostri borsisti di ricerca post-dottorato, Dr.Tyler Leiva e Dr.Alena Golubkova, così come Camille Schlegel, il supervisore assistente di ricerca del nostro laboratorio. Per iniziare, fai crescere gli androidi incorporati in BMM da sette a 10 giorni con supporti condizionati al 50% LWRN per la generazione di enteroidi apical-out o AO.
Rimuovere il supporto intorno alle cupole BMM e aggiungere 500 microlitri di soluzione di recupero cellulare o CRS a un pozzetto. Raschiare la cupola, pipettarla su e giù più volte per omogeneizzare il CRS con gli enteroidi incorporati nelle cupole BMM e aggiungere questa soluzione al pozzetto successivo. Ancora una volta, raschiare la cupola e pipettarla su e giù più volte prima di trasferire la soluzione in un tubo di microcentrifuga.
Aggiungere 500 microlitri di CRS al secondo pozzetto, pipettare su e giù per mescolare bene e trasferirlo nel primo pozzetto. Dal primo pozzetto, raggruppare la soluzione enteroide BMM CRS nello stesso tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri e ripetere questo pooling per i pozzetti rimanenti fino a quando il contenuto di tutti i pozzetti è in CRS. Posizionare le provette di microcentrifuga contenenti la soluzione CRS in pool su un rotatore per un'ora a quattro gradi Celsius.
Quindi centrifugare il tubo della microcentrifuga a 200 X g per tre minuti a quattro gradi Celsius prima di rimuovere il surnatante e sospendere nuovamente il pellet enteroide in un millilitro di mezzo condizionato al 50% LWRN. Trasferire delicatamente 500 microlitri della soluzione enteroide o media risospesa a ciascun pozzetto della piastra di coltura tissutale ultra-bassa a 24 pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2, per tre giorni prima della sperimentazione.
Assicurarsi che gli enteroidi AO siano sospesi per almeno 72 ore prima dell'uso. Trasferire delicatamente tutti gli enteroidi sospesi nei mezzi da ciascun pozzetto in un tubo di microcentrifuga. Centrifugare a 300 X g per tre minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante.
Aggiungere 10 microlitri di cinque milligrammi per millilitro di lipopolisaccaride, o LPS a 500 microlitri di 50% di mezzi condizionati da LWRN per pozzetto per preparare la miscela master e risospendere il pellet enteroide AO dal gruppo di trattamento in 500 microlitri di LPS più il 50% di mezzi condizionati LWRN. Pipettare su e giù per mescolare accuratamente. Aliquote 500 microlitri di sospensione in ciascun pozzetto di una piastra di attacco ultra bassa da 24 pozzetti.
Allo stesso modo, risospendere gli enteroidi AO dal gruppo di controllo non trattato in 500 microlitri di mezzi condizionati al 50% LWRN per pozzetto e aliquote 500 microlitri di questa sospensione in ciascun pozzetto di una piastra di attacco ultra-bassa separata da 24 pozzetti. Indurre ipossia negli enteroidi AO trattati con LPS utilizzando una camera di incubazione modulare con 1% di ossigeno, 5% di anidride carbonica e 94% di azoto e incubare gli enteroidi con ipossia e LPS per 24 ore. Posizionare le colture non trattate e LPS più ipossia, trattate in un incubatore ad anidride carbonica al 5% per 24 ore.
Per misurare la permeabilità paracellulare utilizzando Lucifer Yellow o LY, trasferire delicatamente la sospensione enteroide o media da ciascun pozzetto in un tubo di microcentrifuga. Acqua salina tamponata fosfato caldo di Dulbecco o DPBS e mezzi condizionati al 50% LWRN in bagnomaria a 37 gradi Celsius. Centrifugare la sospensione a 300 X g per tre minuti a temperatura ambiente.
Rimuovere il mezzo e lavare il pellet enteroide con 500 microlitri di DPBS caldo prima della centrifugazione a 300 X g per tre minuti. Rimuovere il surnatante con una micropipetta e ripetere ancora una volta la fase di lavaggio DPBS. Dopo i lavaggi DPBS, aggiungere 450 microlitri di mezzi caldi condizionati al 50% LWRN e aggiungere la sospensione a una piastra da 24 pozzetti.
Quindi aggiungere 50 microlitri di 2,5 milligrammi per millilitro LY a ciascun pozzetto. Ruotare delicatamente la piastra per mescolare e metterla in un incubatore ad anidride carbonica al 5% per due ore. Pipettare delicatamente la sospensione enteroide da ciascun pozzetto in un tubo di microcentrifuga.
Centrifugare e rimuovere il surnatante lasciando dietro di sé il pellet enteroide. Lavare il pellet utilizzando 500 microlitri di DPBS caldo e centrifugarlo. Rimuovere il surnatante lasciando il pellet dietro.
Ripetere tre lavaggi del DPBS prima di sospendere nuovamente il pellet con 1000 microlitri di DPBS freddo e dissociare gli enteroidi mescolando vigorosamente usando una pipetta. Per la curva standard Lucifer Yellow, preparare gli standard diluiti in DPBS come descritto nel testo. Pipettare 150 microlitri di ciascun campione per pozzetto in triplice copia su una piastra da 96 pozzetti.
Misurare la fluorescenza a un picco di eccitazione di 428 nanometri e un picco di emissione di 536 nanometri su un lettore di piastre a fluorescenza. Calcola le concentrazioni utilizzando un software statistico e una curva a quattro parametri che interpola la curva standard. La colorazione immunofluorescente degli enteroidi sospesi in mezzi LWRN al 50% per 72 ore ha mostrato Zo-1 sulla superficie apicale esterna dell'enteroide, mentre la beta catenina è visibile sulla superficie basolaterale.
Ha indicato l'inversione di polarità attesa degli enteroidi confermando una conformazione AO degli enteroidi. Gli enteroidi basolaterali o BO trattati con LPS e ipossia hanno mostrato una permeabilità significativamente aumentata che è stata dimostrata in un test Lucifer Yellow, o LY, dall'aumento dell'assorbimento del colorante LY nel lume enteroide, rispetto ai controlli non trattati. Il test Lucifer Yellow ha anche dimostrato l'aumento dell'assorbimento di LY nel lume degli enteroidi AO trattati rispetto ai controlli non trattati.
Ha confermato l'aumentata permeabilità degli enteroidi AO trattati con LPS e ipossia, rispetto ai controlli non trattati. È importante lavare accuratamente i pellet enteroidi per assicurarsi che tutto il LY extraluminale venga rimosso. Permette la quantificazione accurata del LY intraluminale residuo nel calcolo della permeabilità.
Per l'analisi qualitativa, gli enteroidi possono essere visualizzati tramite microscopia fluorescente per l'assorbimento di LY nel lume. Seguire l'incubazione LY e le successive fasi di lavaggio prima di dissociarsi dalla lettura della micropiastra.
