Lucifer Yellow를 Apical-out enteroids의 배지에 적용하면 3D 모델에서 세 가지 주요 paracellular 장 투과성 경로 모두에 대한 정량적 및 정성적 분석을 위한 간단한 방법을 제공합니다. 엔테로이드 모델을 사용하여 투과성을 평가할 수 있는 비교적 간단한 기술입니다. 우리는 괴사 성 장염에 대한 연구에서이 기술을 사용하고 있습니다.
그러나이 기술은 장내 모델을 사용하여 인간의 장 질환을 연구하는 데 유용 할 수 있습니다. 오늘 절차를 시연하는 것은 박사후 연구원 인 Tyler Leiva 박사와 Alena Golubkova 박사, 그리고 우리 실험실의 연구 보조 감독자 인 Camille Schlegel입니다. 시작하려면 BMM에 내장 된 Android를 정점 또는 AO 엔터 로이드 세대를위한 50 % LWRN 조절 미디어로 7-10 일 동안 성장시킵니다.
BMM 돔 주변에서 배지를 제거하고 500마이크로리터의 세포 회수 용액 또는 CRS를 하나의 웰에 추가합니다. 돔을 긁어 내고 위아래로 여러 번 피펫하여 BMM 돔에 내장 된 엔터 로이드로 CRS를 균질화하고이 용액을 다음 웰에 첨가하십시오. 다시, 돔을 긁어 내고 용액을 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기기 전에 위아래로 여러 번 피펫팅하십시오.
두 번째 웰에 500마이크로리터의 CRS를 추가하고 피펫을 위아래로 하여 잘 섞은 다음 첫 번째 웰로 옮깁니다. 첫 번째 웰에서 CRS 엔터로이드 BMM 용액을 동일한 1.5밀리리터 미세 원심분리 튜브에 풀링하고 모든 웰의 내용물이 CRS에 들어갈 때까지 나머지 웰에 대해 이 풀링을 반복합니다. 풀링된 CRS 용액이 들어 있는 미세 원심분리기 튜브를 섭씨 4도에서 1시간 동안 회전 장치에 놓습니다.
그런 다음 상청액을 제거하기 전에 섭씨 4도에서 3분 동안 200 X g에서 미세 원심분리 튜브를 원심분리하고 장내 펠릿을 50% LWRN 조절 배지 1밀리리터에 다시 현탁합니다. 500 마이크로리터의 재부유된 장내 또는 배지 용액을 초저 부착 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰로 부드럽게 옮깁니다. 실험 전 3일 동안 플레이트를 섭씨 37도에서 5%CO2로 배양합니다.
사용하기 전에 AO 엔테로이드를 최소 72시간 동안 일시 중단했는지 확인하십시오. 각 웰의 배지에 부유 된 모든 엔터 로이드를 미세 원심 분리 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 실온에서 3분 동안 300 X g에서 원심분리하고 상청액을 제거한다.
리포폴리사카라이드 밀리리터당 500마이크로리터의 50%LWRN 조절 배지에 10마이크로리터의 리포폴리사카라이드 또는 LPS를 추가하여 마스터 믹스를 제조하고 처리 그룹의 AO 장용 펠릿을 500마이크로리터의 LPS와 50%LWRN 조절 배지에 다시 현탁시킵니다. 피펫을 위아래로 움직여 완전히 혼합하십시오. 500 마이크로리터의 현탁액을 24웰 초저 부착 플레이트의 각 웰에 분취한다.
유사하게 웰당 500마이크로리터의 50%LWRN 조절 배지에 처리되지 않은 대조군으로부터의 AO 엔테로이드를 재현탁시키고, 이 현탁액의 500마이크로리터를 별도의 24웰 초저 부착 플레이트의 각 웰에 분취한다. 1% 산소, 5% 이산화탄소 및 94% 질소가 있는 모듈식 인큐베이터 챔버를 사용하여 LPS 처리된 AO 엔터로이드에서 저산소증을 유도하고 24시간 동안 저산소증 및 LPS와 함께 엔테로이드를 배양합니다. 처리되지 않은 LPS와 저산소증, 처리된 배양물을 5%이산화탄소 인큐베이터에 24시간 동안 두십시오.
Lucifer Yellow 또는 LY를 사용하여 세포 투과성을 측정하려면 각 웰의 장내 또는 배지 현탁액을 미세 원심분리 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 섭씨 37도 수조에서 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 또는 DPBS 및 50 % LWRN 조절 배지를 따뜻하게합니다. 현탁액을 실온에서 3분 동안 300 X g로 원심분리한다.
배지를 제거하고, 300 X g에서 3분 동안 원심분리하기 전에 500 마이크로리터의 따뜻한 DPBS로 장용 펠릿을 세척한다. 마이크로 피펫으로 상청액을 제거하고 DPBS 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. DPBS 세척 후 450마이크로리터의 따뜻한 50%LWRN 조절 배지를 추가하고 현탁액을 24웰 플레이트에 추가합니다.
그런 다음 밀리리터 LY 당 2.5 밀리그램의 50 마이크로 리터를 각 우물에 첨가하십시오. 접시를 부드럽게 소용돌이 치며 혼합하고 5 % 이산화탄소 인큐베이터에 2 시간 동안 두십시오. 각 웰의 엔테로이드 현탁액을 마이크로 원심분리 튜브에 부드럽게 피펫팅합니다.
그것을 원심분리하고 장내 펠릿을 남기고 상층액을 제거합니다. 500마이크로리터의 따뜻한 DPBS를 사용하여 펠릿을 세척하고 원심분리합니다. 펠릿을 남겨두고 상청액을 제거합니다.
1000 마이크로리터의 차가운 DPBS로 펠릿을 다시 현탁하기 전에 DPBS의 세 번의 세척을 반복하고, 피펫을 사용하여 격렬하게 혼합하여 엔테로이드를 해리합니다. 루시퍼 옐로우 표준 곡선의 경우 텍스트에 설명 된대로 DPBS로 희석 된 표준을 준비하십시오. 웰당 각 시료를 150 마이크로리터씩 96웰 플레이트에 삼중으로 피펫팅한다.
형광 플레이트 판독기에서 428나노미터의 여기 피크와 536나노미터의 방출 피크에서 형광을 측정합니다. 통계 소프트웨어와 표준 곡선을 보간하는 4개의 파라미터 곡선을 사용하여 농도를 계산합니다. 72 시간 동안 50 % LWRN 배지에 현탁 된 엔터 로이드의 면역 형광 염색은 엔터 로이드의 바깥 쪽 정점 표면에 Zo-1을 나타 냈고, 베타 카테닌은 기저 측 표면에서 볼 수 있었다.
그것은 엔테로이드의 AO 형태를 확인하는 엔테로이드의 예상되는 극성 반전을 나타냅니다. LPS 및 저산소증으로 처리된 기저측 아웃 또는 BO 엔테로이드는 처리되지 않은 대조군에 비해 장내 내강으로의 LY 염료의 흡수 증가에 의해 Lucifer Yellow 또는 LY 분석에서 입증된 유의하게 증가된 투과성을 나타냈다. Lucifer Yellow 분석은 또한 처리되지 않은 대조군과 비교하여 처리된 AO 엔테로이드의 내강에서 LY의 증가된 흡수를 입증했습니다.
LPS 및 저산소증으로 처리된 AO 엔테로이드의 증가된 투과성을 처리되지 않은 대조군과 비교하여 확인하였다. 모든 외강 LY가 제거되었는지 확인하기 위해 장용 펠릿을 철저히 세척하는 것이 중요합니다. 투과도를 계산할 때 나머지 관강 내 LAY의 정확한 정량화를 허용합니다.
정성 분석을 위해 엔테로이드는 형광 현미경을 통해 시각화하여 내강으로의 LY 흡수를 확인할 수 있습니다. LY 인큐베이션 및 후속 세척 단계를 거쳐 마이크로플레이트 판독으로부터 해리시키기 전에.
