L’application de Lucifer Yellow aux milieux des entéroïdes Apical-out fournit une méthode simple d’analyse quantitative et qualitative des trois principales voies de perméabilité intestinale paracellulaire dans un modèle 3D. C’est une technique relativement simple qui nous permet d’évaluer la perméabilité à l’aide d’un modèle entéroïde. Nous travaillons avec cette technique dans nos études sur l’entérocolite nécrosante.
Cependant, cette technique peut être utile dans l’étude de toute maladie intestinale humaine, en utilisant un modèle entéroïde. Nos chercheurs postdoctoraux, le Dr Tyler Leiva et la Dre Alena Golubkova, ainsi que Camille Schlegel, superviseure adjointe de recherche de notre laboratoire, feront la démonstration des procédures aujourd’hui. Pour commencer, cultivez les androïdes intégrés dans BMM pendant sept à 10 jours avec des milieux conditionnés à 50% LWRN pour la génération entéroïde apical-out ou AO.
Retirez le média autour des dômes BMM et ajoutez 500 microlitres de solution de récupération cellulaire, ou CRS, à un puits. Grattez le dôme, pipette-le plusieurs fois pour homogénéiser le CRS avec les entéroïdes intégrés dans les dômes BMM et ajoutez cette solution au puits suivant. Encore une fois, grattez le dôme et pipette-le plusieurs fois avant de transférer la solution dans un tube microcentrifugeux.
Ajoutez 500 microlitres de CRS au deuxième puits, pipette de haut en bas pour bien mélanger et transférez-le dans le premier puits. À partir du premier puits, regrouper la solution de BMM entéroïde CRS dans le même tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et répéter cette mise en commun pour les puits restants jusqu’à ce que le contenu de tous les puits soit en CRS. Placez les tubes microcentrifuges contenant une solution de CRS accumulée sur un rotateur pendant une heure à quatre degrés Celsius.
Ensuite, centrifuger le tube microcentrifuge à 200 X g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius avant de retirer le surnageant et de remettre en suspension la pastille entéroïde dans un millilitre de milieu conditionné à 50% LWRN. Transférer doucement 500 microlitres de la solution entéroïde ou de milieu en suspension dans chaque puits de la plaque de culture tissulaire à 24 puits à très faible attache. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2, pendant trois jours avant l’expérimentation.
S’assurer que les entéroïdes AO sont suspendus pendant au moins 72 heures avant utilisation. Transférer délicatement tous les entéroïdes en suspension dans les milieux de chaque puits dans un tube microcentrifugeux. Centrifuger à 300 X g pendant trois minutes à température ambiante et retirer le surnageant.
Ajouter 10 microlitres de cinq milligrammes par millilitre de lipopolysaccharide, ou LPS à 500 microlitres de milieu conditionné à 50% LWRN par puits pour préparer le mélange principal, et remettre en suspension la pastille entéroïde AO du groupe de traitement dans 500 microlitres de LPS plus 50% de milieu conditionné LWRN. Pipeter de haut en bas pour bien mélanger. Aliquote 500 microlitres de suspension dans chaque puits d’une plaque de fixation ultra basse de 24 puits.
De même, remettre en suspension les entéroïdes AO du groupe témoin non traité dans 500 microlitres de milieu conditionné à 50% par puits et aliquote 500 microlitres de cette suspension dans chaque puits d’une plaque de fixation ultra-basse séparée de 24 puits. Induire l’hypoxie chez les entéroïdes AO traités au LPS à l’aide d’une chambre d’incubateur modulaire avec 1% d’oxygène, 5% de dioxyde de carbone et 94% d’azote, et incuber les entéroïdes avec hypoxie et LPS pendant 24 heures. Placez les cultures traitées non traitées et LPS plus hypoxie dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures.
Pour mesurer la perméabilité paracellulaire à l’aide de Lucifer Yellow ou LY, transférez doucement l’entéroïde ou la suspension de milieu de chaque puits dans un tube microcentrifugeux. Solution saline tamponnée au phosphate chaud de Dulbecco ou DPBS, et milieu conditionné à 50% de REL dans un bain-marie de 37 degrés Celsius. Centrifuger la suspension à 300 X g pendant trois minutes à température ambiante.
Retirer le média et laver la pastille entéroïde avec 500 microlitres de DPBS chaud avant centrifugation à 300 X g pendant trois minutes. Retirez le surnageant avec une micropipette et répétez l’étape de lavage DPBS une fois de plus. Après le lavage du DPBS, ajoutez 450 microlitres de média chaud conditionné à 50% LWRN et ajoutez la suspension à une plaque de 24 puits.
Ajoutez ensuite 50 microlitres de 2,5 milligrammes par millilitre de LY à chaque puits. Remuez doucement la plaque pour mélanger et placez-la dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone pendant deux heures. Pipeter doucement la suspension entéroïde de chaque puits dans un tube microcentrifugeux.
Centrifugez-le et retirez le surnageant en laissant la pastille entéroïde derrière. Lavez la pastille à l’aide de 500 microlitres de DPBS chaud et centrifugez-la. Retirez le surnageant en laissant la pastille derrière.
Répéter trois lavages du DPBS avant de remettre en suspension la pastille avec 1000 microlitres de DPBS froid, et dissocier les entéroïdes en mélangeant vigoureusement à l’aide d’une pipette. Pour la courbe standard jaune Lucifer, préparez les étalons dilués dans DPBS comme décrit dans le texte. Pipeter 150 microlitres de chaque échantillon par puits en triple sur une plaque de 96 puits.
Mesurez la fluorescence à un pic d’excitation de 428 nanomètres et un pic d’émission de 536 nanomètres sur un lecteur de plaque de fluorescence. Calculer les concentrations à l’aide d’un logiciel statistique et d’une courbe à quatre paramètres interpolant la courbe standard. La coloration immunofluorescente des entéroïdes en suspension dans un milieu à 50% LWRN pendant 72 heures a montré Zo-1 sur la surface apicale externe de l’entéroïde, tandis que la bêta-caténine est observée sur la surface basolatérale.
Il a indiqué l’inversion de polarité attendue des entéroïdes confirmant une conformation AO des entéroïdes. Les entéroïdes basolatéraux, ou BO traités avec LPS et hypoxie, ont montré une perméabilité significativement accrue, ce qui a été démontré dans un test Lucifer Yellow, ou LY, par l’absorption accrue de colorant LY dans la lumière entéroïde, par rapport aux témoins non traités. Le test Lucifer Yellow a également démontré l’absorption accrue de LY dans la lumière des entéroïdes AO traités par rapport aux témoins non traités.
Il a confirmé la perméabilité accrue des entéroïdes AO traités par LPS et hypoxie, par rapport aux témoins non traités. Il est important de bien laver les pastilles entéroïdes pour s’assurer que tout le LY extraluminal est éliminé. Il permet la quantification précise de la LY intraluminale restante dans le calcul de la perméabilité.
Pour l’analyse qualitative, les entéroïdes peuvent être visualisés par microscopie fluorescente pour l’absorption de LY dans la lumière. Après l’incubation de LY et les étapes de lavage ultérieures avant de se dissocier de la lecture de microplaques.
