A aplicação de Lucifer Yellow ao meio de enteróides Apical-out fornece um método simples para análise quantitativa e qualitativa de todas as três principais vias de permeabilidade intestinal paracelular em um modelo 3D. É uma técnica relativamente simples que nos permite avaliar a permeabilidade usando um modelo enteróide. Estamos trabalhando com essa técnica em nossos estudos de enterocolite necrosante.
No entanto, esta técnica pode ser útil no estudo de qualquer doença intestinal humana, utilizando um modelo enteróide. Demonstrando os procedimentos de hoje estarão nossos bolsistas de pesquisa de pós-doutorado, Dr. Tyler Leiva e Dra. Alena Golubkova, bem como Camille Schlegel, supervisora assistente de pesquisa de nosso laboratório. Para começar, aumente os Androids incorporados no BMM por sete a 10 dias com meios condicionados a 50% LWRN para a geração de enteroides apical-out ou AO.
Remova a mídia ao redor das cúpulas BMM e adicione 500 microlitros de solução de recuperação celular, ou CRS a um poço. Raspe a cúpula, pipete-a para cima e para baixo várias vezes para homogeneizar o SRI com os enteróides embutidos nas cúpulas BMM e adicione esta solução ao próximo poço. Novamente, raspe a cúpula e pipete-a para cima e para baixo várias vezes antes de transferir a solução para um tubo de microcentrífuga.
Adicione 500 microlitros de SRI ao segundo poço, pipeta para cima e para baixo para misturá-lo bem e transferi-lo para o primeiro poço. Desde o primeiro poço, agrupe a solução de BMM enteróide CRS no mesmo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros e repita esse agrupamento para os poços restantes até que o conteúdo de todos os poços esteja em SRC. Colocar os tubos de microcentrífuga contendo solução de SRI agrupada num rotador durante uma hora a quatro graus Celsius.
Em seguida, centrifugar o tubo de microcentrífuga a 200 X g por três minutos a quatro graus Celsius antes de remover o sobrenadante e ressuspender o pellet enteróide em um mililitro de meio condicionado a 50% LWRN. Transfira suavemente 500 microlitros da solução enteróide ou média ressuspensa para cada poço da placa de cultura de tecido de 24 poços de fixação ultrabaixa. Incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de CO2, durante três dias antes da experimentação.
Certifique-se de que os enteróides AO estão suspensos por pelo menos 72 horas antes do uso. Transfira suavemente todos os enteróides suspensos em meios de cada poço para um tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 300 X g durante três minutos à temperatura ambiente e remover o sobrenadante.
Adicione 10 microlitros de cinco miligramas por mililitro de lipopolissacarídeo, ou LPS, a 500 microlitros de meio condicionado a 50% LWRN por poço para preparar a mistura mestra e ressuspenda o pellet enteróide AO do grupo de tratamento em 500 microlitros de LPS mais 50% de meio condicionado LWRN. Pipeta para cima e para baixo para misturar bem. Aliquot 500 microlitros de suspensão em cada poço de uma placa de fixação ultra baixa de 24 poços.
Da mesma forma, ressuspeite os enteróides AO do grupo de controle não tratado em 500 microlitros de meio condicionado a 50% LWRN por poço e alíquota de 500 microlitros desta suspensão em cada poço de uma placa de fixação ultrabaixa separada de 24 poços. Induzir hipóxia nos enteroides AO tratados com LPS usando uma câmara incubadora modular com oxigênio a 1%, dióxido de carbono a 5% e nitrogênio a 94% e incubar os enteroides com hipóxia e LPS por 24 horas. Coloque as culturas não tratadas e LPS mais hipóxia, tratadas em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% por 24 horas.
Para medir a permeabilidade paracelular usando Lucifer Yellow ou LY, transfira suavemente a suspensão enteróide ou média de cada poço para um tubo de microcentrífuga. Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco quente ou DPBS, e meio condicionado a 50% LWRN em um banho de água de 37 graus Celsius. Centrifugar a suspensão a 300 X g durante três minutos à temperatura ambiente.
Retire o meio e lave o pellet enteróide com 500 microlitros de DPBS quente antes da centrifugação a 300 X g por três minutos. Remova o sobrenadante com uma micropipeta e repita a etapa de lavagem do DPBS mais uma vez. Após as lavagens do DPBS, adicione 450 microlitros de meio condicionado quente a 50% LWRN e adicione a suspensão a uma placa de 24 poços.
Em seguida, adicione 50 microlitros de 2,5 miligramas por mililitro LY a cada poço. Gire a placa suavemente para misturar e coloque-a em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% por duas horas. Pipetar suavemente a suspensão enteróide de cada poço para um tubo de microcentrífuga.
Centrifuga-o e remova o sobrenadante que deixa a pelota enteróide para trás. Lave o pellet usando 500 microlitros de DPBS morno e centrifuga-o. Remova o sobrenadante deixando a pelota para trás.
Repita três lavagens do DPBS antes de ressuspender o pellet com 1000 microlitros de DPBS frio e dissociar os enteróides por mistura vigorosa usando uma pipeta. Para a curva padrão Amarelo Lúcifer, prepare os padrões diluídos em DPBS conforme descrito no texto. Pipeta 150 microlitros de cada amostra por poço em triplicado em uma placa de 96 poços.
Meça a fluorescência em um pico de excitação de 428 nanômetros e um pico de emissão de 536 nanômetros em um leitor de placas de fluorescência. Calcular as concentrações usando um software estatístico e uma curva de quatro parâmetros interpolando a curva padrão. A coloração imunofluorescente dos enteroides suspensos em meio LWRN a 50% por 72 horas mostrou Zo-1 na superfície apical externa do enteróide, enquanto a beta catenina é observada na superfície basolateral.
Indicou a reversão de polaridade esperada dos enteróides, confirmando uma conformação AO dos enteróides. Os enteróides basolaterais para fora, ou BO tratados com LPS e hipóxia, mostraram permeabilidade significativamente aumentada que foi demonstrada em um ensaio Lucifer Yellow, ou LY pelo aumento da absorção de corante LY no lúmen enteróide, em comparação com controles não tratados. O ensaio Lucifer Yellow também demonstrou o aumento da captação de LY no lúmen dos enteróides AO tratados em comparação com os controles não tratados.
Confirmou o aumento da permeabilidade dos enteróides AO tratados com LPS e hipóxia, em comparação com os controles não tratados. É importante lavar bem os pellets enteróides para garantir que todo o LY extraluminal seja removido. Permite a quantificação precisa do LY intraluminal remanescente no cálculo da permeabilidade.
Para análise qualitativa, os enteróides podem ser visualizados via microscopia fluorescente para absorção de LY no lúmen. Após a incubação do LY e as etapas subsequentes de lavagem antes de dissociar da leitura da Microplaca.
