La aplicación de Lucifer Yellow a los medios de enteroides apicales proporciona un método simple para el análisis cuantitativo y cualitativo de las tres principales vías de permeabilidad intestinal paracelular en un modelo 3D. Es una técnica relativamente sencilla que nos permite evaluar la permeabilidad utilizando un modelo enteroide. Estamos trabajando con esta técnica en nuestros estudios de enterocolitis necrosante.
Sin embargo, esta técnica puede ser útil en el estudio de cualquier enfermedad intestinal humana, utilizando un modelo enteroide. Demostrando los procedimientos hoy estarán nuestros becarios de investigación postdoctorales, el Dr. Tyler Leiva y la Dra. Alena Golubkova, así como Camille Schlegel, la Supervisora Asistente de Investigación de nuestro laboratorio. Para comenzar, cultive los androides integrados en BMM durante siete a 10 días con 50% de medios acondicionados LWRN para la generación enteroide apical-out o AO.
Retire los medios de alrededor de los domos BMM y agregue 500 microlitros de solución de recuperación celular, o CRS a un pocillo. Raspa la cúpula, pipetea hacia arriba y hacia abajo varias veces para homogeneizar el CRS con los enteroides incrustados en las cúpulas BMM, y añade esta solución al siguiente pocillo. Nuevamente, raspe la cúpula y pipetearla hacia arriba y hacia abajo varias veces antes de transferir la solución a un tubo de microcentrífuga.
Agregue 500 microlitros de CRS al segundo pocillo, pipete hacia arriba y hacia abajo para mezclarlo bien y transfiéralo al primer pocillo. Desde el primer pozo, agrupe la solución BMM enteroide CRS en el mismo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y repita este agrupamiento para los pozos restantes hasta que el contenido de todos los pocillos esté en CRS. Coloque los tubos de microcentrífuga que contienen la solución de CRS agrupada en un rotador durante una hora a cuatro grados centígrados.
Luego centrifugar el tubo de microcentrífuga a 200 X g durante tres minutos a cuatro grados centígrados antes de retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet enteroide en un mililitro de medio acondicionado al 50% LWRN. Transfiera suavemente 500 microlitros de la solución enteroide o medio resuspendido a cada pocillo de la placa de cultivo de tejido de 24 pocillos de fijación ultrabaja. Incubar la placa a 37 grados centígrados con 5% de CO2, durante tres días antes de la experimentación.
Asegúrese de que los enteroides AO estén suspendidos durante al menos 72 horas antes de su uso. Transfiera suavemente todos los enteroides suspendidos en medios de cada pocillo a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 300 X g durante tres minutos a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante.
Agregue 10 microlitros de cinco miligramos por mililitro de lipopolisacárido, o LPS a 500 microlitros de medios acondicionados al 50% LWRN por pocillo para preparar la mezcla maestra, y vuelva a suspender el pellet enteroide AO del grupo de tratamiento en 500 microlitros de LPS más 50% de medios acondicionados LWRN. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Alícuota 500 microlitros de suspensión en cada pocillo de una placa de fijación ultra baja de 24 pocillos.
De manera similar, vuelva a suspender los enteroides AO del grupo de control no tratado en 500 microlitros de medios acondicionados LWRN al 50% por pocillo y alícuota 500 microlitros de esta suspensión en cada pocillo de una placa de fijación ultra baja separada de 24 pocillos. Inducir hipoxia en los enteroides AO tratados con LPS utilizando una cámara de incubadora modular con 1% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono y 94% de nitrógeno, e incubar los enteroides con hipoxia y LPS durante 24 horas. Coloque los cultivos tratados sin tratar y LPS más hipoxia, en una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante 24 horas.
Para medir la permeabilidad paracelular usando Lucifer Yellow o LY, transfiera suavemente la suspensión enteroide o del medio de cada pocillo a un tubo de microcentrífuga. Caltione la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco o DPBS, y los medios acondicionados al 50% de LWRN en un baño de agua de 37 grados centígrados. Centrifugar la suspensión a 300 X g durante tres minutos a temperatura ambiente.
Retire el medio y lave el pellet enteroide con 500 microlitros de DPBS caliente antes de centrifugarlo a 300 X g durante tres minutos. Retire el sobrenadante con una micropipeta y repita el paso de lavado DPBS una vez más. Después de lavar el DPBS, agregue 450 microlitros de medios acondicionados calientes al 50% LWRN y agregue la suspensión a una placa de 24 pocillos.
Luego agregue 50 microlitros de 2.5 miligramos por mililitro LY a cada pozo. Agite la placa suavemente para mezclar y colóquela en una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante dos horas. Pipetear suavemente la suspensión enteroide de cada pocillo en un tubo de microcentrífuga.
Centrifugarlo y retirar el sobrenadante dejando atrás el pellet enteroide. Lave el pellet con 500 microlitros de DPBS tibio y centrifugarlo. Retire el sobrenadante dejando atrás el pellet.
Repita tres lavados del DPBS antes de volver a suspender el pellet con 1000 microlitros de DPBS frío, y disocie los enteroides mezclando vigorosamente con una pipeta. Para la curva estándar de Lucifer Yellow, prepare los estándares diluidos en DPBS como se describe en el texto. Pipetear 150 microlitros de cada muestra por pocillo por triplicado en una placa de 96 pocillos.
Mida la fluorescencia a un pico de excitación de 428 nanómetros y un pico de emisión de 536 nanómetros en un lector de placas de fluorescencia. Calcule las concentraciones utilizando un software estadístico y una curva de cuatro parámetros interpolando la curva estándar. La tinción inmunofluorescente de los enteroides suspendidos en medios LWRN al 50% durante 72 horas mostró Zo-1 en la superficie apical externa del enteroide, mientras que la beta catenina se observa en la superficie basolateral.
Indicó la inversión de polaridad esperada de enteroides confirmando una conformación AO de enteroides. Los enteroides basolaterales o BO tratados con LPS e hipoxia mostraron un aumento significativo de la permeabilidad que se demostró en un ensayo de amarillo de Lucifer o LY por la mayor absorción de colorante LY en la luz enteroide, en comparación con los controles no tratados. El ensayo de amarillo de Lucifer también demostró la mayor absorción de LY en el lumen de los enteroides AO tratados en comparación con los controles no tratados.
Confirmó el aumento de la permeabilidad de los enteroides AO tratados con LPS e hipoxia, en comparación con los controles no tratados. Es importante lavar bien los pellets enteroides para asegurarse de que se elimine todo el LY extraluminal. Permite la cuantificación precisa del LY intraluminal restante en el cálculo de la permeabilidad.
Para el análisis cualitativo, los enteroides se pueden visualizar a través de microscopía fluorescente para la absorción de LY en el lumen. Siguiendo la incubación LY y los pasos de lavado posteriores antes de disociar la lectura de microplacas.
