Применение Люцифера Желтого к среде апикальных энтероидов обеспечивает простой метод количественного и качественного анализа всех трех основных путей проницаемости параклеточного кишечника в 3D-модели. Это относительно простой метод, который позволяет нам оценить проницаемость с помощью энтероидной модели. Мы работаем с этой техникой в наших исследованиях некротизирующего энтероколита.
Тем не менее, этот метод может быть полезен при изучении любого кишечного заболевания человека, используя энтероидную модель. Демонстрацию процедур сегодня продемонстрируют наши постдокторанты, доктор Тайлер Лейва и доктор Алена Голубкова, а также Камилла Шлегель, научный сотрудник нашей лаборатории. Для начала вырастите Android, встроенные в BMM в течение семи-10 дней с 50% кондиционированными носителями LWRN для апикального или энтероидного поколения AO.
Удалите носитель вокруг куполов BMM и добавьте 500 микролитров раствора для восстановления клеток или CRS в одну лунку. Соскоблите купол, несколько раз пипеткой вверх и вниз, чтобы гомогенизировать CRS энтероидами, встроенными в купола BMM, и добавьте это решение в следующую скважину. Опять же, соскоблите купол и несколько раз пипеткой вверх и вниз, прежде чем переносить раствор в трубку микроцентрифуги.
Добавьте 500 микролитров CRS во вторую лунку, пипетку вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать и переложить в первую лунку. Из первой скважины объедините энтероидный раствор BMM CRS в ту же 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку и повторяйте это объединение для оставшихся скважин до тех пор, пока содержимое всех скважин не окажется в CRS. Поместите микроцентрифужные трубки, содержащие объединенный раствор CRS, на ротатор в течение одного часа при четырех градусах Цельсия.
Затем центрифугируют микроцентрифужную трубку при 200 Х г в течение трех минут при четырех градусах Цельсия перед удалением супернатанта и повторно суспендируют энтероидную гранулу в одном миллилитре 50% кондиционированной среды LWRN. Осторожно перенесите 500 микролитров повторно суспендированного раствора энтероида или среды в каждую лунку ультранизкого прикрепления 24 пробки тканевой культуральной пластины. Инкубируйте пластину при температуре 37 градусов цельсия с 5% CO2 в течение трех дней до экспериментов.
Убедитесь, что энтероиды АО приостановлены в течение не менее 72 часов перед использованием. Аккуратно перенесите все энтероиды, взвешенные в средах, из каждой лунки в микроцентрифужную трубку. Центрифугировать при 300 Х г в течение трех минут при комнатной температуре и удалить супернатант.
Добавьте 10 микролитров по пять миллиграммов на миллилитр липополисахарида, или LPS, к 500 микролитрам 50% кондиционированной среды LWRN на лунку для приготовления мастер-микса и повторно суспендируйте энтероидную гранулу AO из группы обработки в 500 микролитров LPS плюс 50% кондиционированную среду LWRN. Пипетка вверх и вниз для тщательного перемешивания. Aliquot 500 микролитров суспензии в каждую скважину из 24 лунок сверхнизкой крепежной пластины.
Аналогичным образом повторно суспендируют энтероиды АО из необработанной контрольной группы в 500 микролитрах 50%-ной кондиционированной среды LWRN на лунку и аликвотируют 500 микролитров этой суспензии в каждую лунку отдельной 24-луночной сверхнизкой крепежной пластины. Индуцируют гипоксию в энтероидах, обработанных ЛПС, используя модульную камеру инкубатора с 1% кислорода, 5% углекислого газа и 94% азота, и инкубируют энтероиды с гипоксией и ЛПС в течение 24 часов. Поместите необработанные и ЛПС плюс гипоксия, обработанные культуры, в 5% инкубатор углекислого газа на 24 часа.
Чтобы измерить параклеточную проницаемость с помощью Люцифера Желтого или LY, осторожно перенесите энтероидную или среду суспензию из каждой скважины в микроцентрифужную трубку. Теплый фосфатный буферизованный физиологический раствор Dulbecco или DPBS и 50% кондиционированная среда LWRN на водяной бане с температурой 37 градусов цельсия. Центрифугировать суспензию при 300 Х г в течение трех минут при комнатной температуре.
Удалите среду и промыть энтероидную гранулу 500 микролитрами теплого DPBS перед центрифугированием при 300 X г в течение трех минут. Удалите супернатант с помощью микропипетки и повторите этап стирки DPBS еще раз. После промывки DPBS добавьте 450 микролитров теплой 50%-ной кондиционированной среды LWRN и добавьте суспензию на пластину с 24 лунками.
Затем добавьте 50 микролитров по 2,5 миллиграмма на миллилитр LY к каждой лунке. Осторожно покрутите пластину, чтобы перемешать, и поместите ее в инкубатор с 5% углекислым газом на два часа. Аккуратно выложите энтероидную суспензию из каждой лунки в микроцентрифужную трубку.
Центрифугируйте его и удалите супернатант, оставив энтероидную гранулу позади. Вымойте гранулу с помощью 500 микролитров теплого DPBS и центрифугируйте ее. Удалите супернатант, оставив гранулу позади.
Повторите три промывки DPBS перед повторной приостановкой гранулы с 1000 микролитрами холодного DPBS и диссоциируют энтероиды путем энергичного смешивания с использованием пипетки. Для стандартной кривой Люцифера Желтого подготовьте стандарты, разбавленные в DPBS, как описано в тексте. Пипетка 150 микролитров каждого образца на скважину в трех экземплярах на пластине из 96 скважин.
Измерьте флуоресценцию при пике возбуждения 428 нанометров и пике излучения 536 нанометров на считывателе флуоресцентных пластин. Рассчитайте концентрации с помощью статистического программного обеспечения и четырехпараметрической кривой, интерполирующей стандартную кривую. Иммунофлуоресцентное окрашивание энтероидов, взвешенных в 50% среде LWRN в течение 72 часов, показало Zo-1 на наружной апикальной поверхности энтероида, в то время как бета-катенин виден на базолатеральной поверхности.
Он указал на ожидаемое изменение полярности энтероидов, подтверждающее конформацию энтероидов АО. Базолатеральные энтероиды, или ЭНТЕРОИДЫ БО, обработанные ЛПС и гипоксией, показали значительно повышенную проницаемость, которая была продемонстрирована в анализе Люцифера Желтого или LY увеличением поглощения красителя LY в энтероидный просвет по сравнению с необработанным контролем. Анализ Lucifer Yellow также продемонстрировал повышенное поглощение LY в просвете обработанных энтероидов AO по сравнению с необработанным контролем.
Он подтвердил повышенную проницаемость энтероидов АО, получавших ЛПС и гипоксию, по сравнению с необработанным контролем. Важно тщательно промыть энтероидные гранулы, чтобы убедиться, что все экстралюминальные LY удалены. Это позволяет точно количественно оценить оставшуюся внутрипросветную LY при расчете проницаемости.
Для качественного анализа энтероиды могут быть визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии для поглощения LY в просвет. После инкубации LY и последующих этапов промывки перед диссоциацией от показаний Microplate.
