Lucifer Yellow'un Apical-out enteroidlerin ortamına uygulanması, 3D modelde üç ana parasellüler bağırsak geçirgenlik yolunun hepsinin nicel ve kalitatif analizi için basit bir yöntem sağlar. Bir enteroid model kullanarak geçirgenliği değerlendirmemizi sağlayan nispeten basit bir tekniktir. Nekrotizan enterokolitle ilgili çalışmalarımızda bu teknikle çalışıyoruz.
Bununla birlikte, bu teknik, bir enteroid modeli kullanarak herhangi bir insan bağırsak hastalığını incelemede yararlı olabilir. Bugün prosedürleri gösterenler, Doktora Sonrası Araştırma Görevlilerimiz Dr. Tyler Leiva ve Dr. Alena Golubkova'nın yanı sıra laboratuvarımızdan Araştırma Asistanı Süpervizörü Camille Schlegel olacak. Başlamak için, BMM'ye gömülü Android'leri yedi ila 10 gün boyunca apikal-out veya AO enteroid üretimi için% 50 LWRN şartlandırılmış medya ile büyütün.
Medyayı BMM kubbelerinin etrafından çıkarın ve bir kuyucuğa 500 mikrolitre hücre kurtarma çözeltisi veya CRS ekleyin. Kubbeyi kazıyın, BMM kubbelerine gömülü enteroidlerle CRS'yi homojenize etmek için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve bu çözeltiyi bir sonraki kuyucuğa ekleyin. Yine, kubbeyi kazıyın ve çözeltiyi bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmadan önce birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
İkinci kutuya 500 mikrolitre CRS ekleyin, iyice karıştırmak ve ilk kuyucuğa aktarmak için yukarı ve aşağı pipet ekleyin. İlk kuyudan, CRS enteroid BMM çözeltisini aynı 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve tüm kuyuların içeriği CRS'de olana kadar kalan kuyucuklar için bu havuzu tekrarlayın. Havuzlanmış CRS çözeltisi içeren mikrosantrifüj tüplerini, dört santigrat derecede bir saat boyunca bir rotatör üzerine yerleştirin.
Daha sonra, süpernatanı çıkarmadan önce mikrosantrifüj tüpünü 200 X g'de üç dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin ve enteroid peleti% 50 LWRN şartlandırılmış ortamın bir mililitresinde yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınmış enteroid veya medya çözeltisinin 500 mikrolitresini, ultra düşük ataşman 24 kuyucuklu doku kültürü plakasının her bir kuyucuğuna nazikçe aktarın. Plakayı, deneyden önceki üç gün boyunca% 5 CO2 ile 37 santigrat derecede inkübe edin.
AO enteroidlerinin kullanımdan önce en az 72 saat boyunca askıya alındığından emin olun. Ortamda asılı olan tüm enteroidleri her bir kuyucuktan bir mikrosantrifüj tüpüne yavaşça aktarın. Oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300 X g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
Ana karışımı hazırlamak için mililitre lipopolisakkarit başına 10 mikrolitre beş miligram lipopolisakkarit veya LPS'yi kuyucuk başına 500 mikrolitre% 50 LWRN şartlandırılmış ortama ekleyin ve AO enteroid peletini tedavi grubundan 500 mikrolitre LPS veya% 50 LWRN şartlandırılmış ortama yeniden askıya alın. İyice karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Aliquot 500 mikrolitre süspansiyon, 24 kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakasının her bir kuyucuğuna yerleştirilir.
Benzer şekilde, işlenmemiş kontrol grubundaki AO enteroidlerini, kuyu başına% 50 LWRN şartlandırılmış ortamın 500 mikrolitresinde yeniden askıya alın ve bu süspansiyonun 500 mikrolitresini ayrı bir 24 kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakasının her bir kuyucuğuna alın. LPS ile muamele edilmiş AO enteroidlerinde% 1 oksijen,% 5 karbondioksit ve% 94 azot içeren modüler bir inkübatör odası kullanarak hipoksi indükleyin ve enteroidleri 24 saat boyunca hipoksi ve LPS ile inkübe edin. Tedavi edilmemiş ve LPS artı hipoksi, tedavi edilmiş kültürleri 24 saat boyunca% 5'lik bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.
Lucifer Yellow veya LY kullanarak parasellüler geçirgenliği ölçmek için, enteroid veya ortam süspansiyonunu her bir kuyucuktan bir mikrosantrifüj tüpüne yavaşça aktarın. Sıcak Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin veya DPBS ve 37 santigrat derece su banyosunda %50 LWRN şartlandırılmış ortam. Süspansiyonu oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300 X g'de santrifüj yapın.
Ortamı çıkarın ve enteroid peleti üç dakika boyunca 300 X g'de santrifüjlemeden önce 500 mikrolitre ılık DPBS ile yıkayın. Süpernatantı bir mikro pipetle çıkarın ve DPBS yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın. DPBS yıkandıktan sonra, 450 mikrolitre sıcak% 50 LWRN şartlandırılmış ortam ekleyin ve süspansiyonu 24 kuyucuklu bir plakaya ekleyin.
Daha sonra her bir kuyucuğa mililitre LY başına 50 mikrolitre 2,5 miligram ekleyin. Karıştırmak için plakayı yavaşça döndürün ve iki saat boyunca% 5'lik bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Her bir kuyucuktan enteroid süspansiyonu nazikçe bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
Santrifüj yapın ve enteroid peleti geride bırakarak süpernatantı çıkarın. Peleti 500 mikrolitre ılık DPBS kullanarak yıkayın ve santrifüj yapın. Pelet'i geride bırakarak süpernatantı çıkarın.
Peletin 1000 mikrolitre soğuk DPBS ile yeniden askıya alınmasından önce DPBS'nin üç yıkamasını tekrarlayın ve enteroidleri bir pipet kullanarak kuvvetli bir şekilde karıştırarak ayırın. Lucifer Sarı standart eğrisi için, metinde açıklandığı gibi DPBS cinsinden seyreltilmiş standartları hazırlayın. Pipet, 96 kuyucuklu bir plaka üzerinde üçlü olarak kuyucuk başına her numunenin 150 mikrolitresidir.
Bir floresan plakası okuyucusunda floresanı 428 nanometrelik bir uyarma zirvesinde ve 536 nanometrelik bir emisyon zirvesinde ölçün. İstatistiksel yazılım ve standart eğriyi enterpolasyon yapan dört parametreli bir eğri kullanarak konsantrasyonları hesaplayın. 72 saat boyunca %50 LWRN ortamında asılı kalan enteroidlerin immünofloresan boyanması, enteroidin dış apikal yüzeyinde Zo-1'i gösterirken, bazolateral yüzeyde beta katenin görülür.
Enteroidlerin AO konformasyonunu doğrulayan enteroidlerin beklenen polarite tersine çevrilmesini gösterdi. LPS ve hipoksi ile tedavi edilen bazolateral çıkış veya BO enteroidleri, tedavi edilmeyen kontrollere kıyasla, bir Lucifer Sarı veya LY tahlilinde LY boyasının enteroid lümene artan alımı ile gösterilen geçirgenliğin önemli ölçüde arttığını göstermiştir. Lucifer Yellow testi ayrıca, tedavi edilmemiş kontrollere kıyasla tedavi edilen AO enteroidlerinin lümeninde LY alımının arttığını göstermiştir.
LPS ve hipoksi ile tedavi edilen AO enteroidlerinin geçirgenliğinin arttığını, tedavi edilmeyen kontrollere kıyasla doğruladı. Tüm ekstraluminal LY'nin çıkarıldığından emin olmak için enteroid peletleri iyice yıkamak önemlidir. Geçirgenliğin hesaplanmasında kalan intraluminal LY'nin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlar.
Kalitatif analiz için, enteroidler lümene LY alımı için floresan mikroskopi ile görselleştirilebilir. Mikroplaka okumasından ayrılmadan önce LY inkübasyonunu ve sonraki yıkama adımlarını takip edin.
