この方法では、成熟接合部を有する分極腸上皮細胞全体で様々な均等化株のトランスサイトーシス能力を比較することができます。これは、リソースや時間の広範な使用を必要としない比較的簡単な技術であり、新生児大腸菌侵襲性疾患の病因における重要なステップを調査することができます。手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるジョシュ・ウィートリーです。
バイオセーフティキャビネット内で作業し、T84細胞をポリエチレンテレフタレート膜細胞培養トランスウェルインサートにシードします。Transwellインサートを保持するように設計された24ウェルプレートに、必要な数の収集ウェルに1ミリリットルの組織培養培地または抗生物質を含むTCMを満たします。これらのインサートに、抗生物質を含む500マイクロリットルのTCMに懸濁した10〜5番目のT84細胞を1回播種します。
播種後約48時間で、単層がコンフルエントになり始めたかどうかを光学顕微鏡で確認します。播種後2日ごとに、OMメーターまたはEVOMあたりの上皮ボルトを使用して経上皮電気抵抗またはTEERを測定および記録します。TEERを測定する前に、電気プローブを5ミリリットルの70%エタノールに10〜15分間沈めて除染します。
プローブを取り外し、余分なエタノールを振り落とし、バイオセーフティキャビネット内で10分間風乾させます。乾燥した除染プローブを、抗生物質を含む1ミリリットルのTCMを含む滅菌ウェルに入れ、内部に抗生物質を含む500マイクロリットルのTCMを含む滅菌インサートを入れて、EVOMとプローブをテストします。EVOM の読み取り値が 200 OM 未満であることを確認します。この空白値を記録して、後の抵抗計算で使用します。
抗生物質を含むTCMのチューブからプローブを取り外します。長い電極を収集ウェルに入れた状態で、プローブを最初のインサートにゆっくりと下げます。電極が収集ウェルの底に触れるようにしますが、インサート内の上皮単層と短い電極を破壊する可能性があるため、押し下げないでください。
終了したら、エタノール中のプローブを除染します。T84セルを含む各インサートから得られた各値からブランク抵抗値を差し引きます。次に、各チップの結果抵抗に各チップの下部の面積を掛けて、最終的なTEER測定値を取得します。
TEERが1平方センチメートルあたり1000OMに達すると、上皮単層は成熟し、感染アッセイの準備が整います。TEERが成熟したら、1〜2日ごとに細胞に新しい培地を提供します。新しい24ウェルプレートに、抗生物質を含む1ミリリットルのTCMを、シードインサートごとに1ウェルに追加します。
滅菌鉗子を使用して、インサートを新しく補充したウェルに慎重に移します。メディアをドライブに挿入します。プレートを傾けてインサートから古い培地を取り出し、チップの側面に沿ってピペットチップでメディアをそっと取り出します。
抗生物質を含む500マイクロリットルのTCMをインサートに追加し、単層を視覚化して、無傷のままであることを確認します。実験の前日に、TEERを測定して記録します。プレートウェルに抗生物質を含まない1ミリリットルのTCMと培地を交換し、インサートに500マイクロリットルを入れ替えます。
ラベル付き15ミリリットルのコニカルチューブに5ミリリットルの滅菌溶解ブロスまたはLBを入れ、滅菌潤滑剤を使用して、1つの大腸菌株からの1つのコロニーをブロスに接種します。チューブのキャップを緩めた状態で培養液を一晩インキュベートします。翌日、一晩LB培養から250マイクロリットルを抗生物質なしで25ミリリットルのTCMに50ミリリットルの円錐管に入れます。
チューブを2時間インキュベートします。各インサート全体のTEERを測定します。これらを時間Tからゼロ時のTEERとして記録します。
インサートを新しいプレートのウェルに移動し、メディアを交換します。新しい収集ウェルに500マイクロリットルを入れ、手の抗生物質なしで400マイクロリットルのTCMを挿入します。感染時までインサートを組織培養インキュベーター内に保管してください。
2時間後、朝の細菌培養物をシェーカーと遠心分離機から取り出します。抗生物質なしでペレットをTCMに再懸濁します。次に、分光光度計を使用して光学濃度またはODを0.7または0.9に調整し、さらに1ミリリットルあたり100万コロニー形成単位またはCFUの濃度に希釈します。
各インサートに100マイクロリットルのOD調整接種材料を感染させます。時刻をメモし、時間ゼロ時間として記録します。接種菌懸濁液を、正方形のLBオーガープレート上に10マイクロリットルのアリコートをめっきするトラック希釈法を使用して、ミリリットルあたりの量CFUまで配置します。
接種後30分ごとに、抗生物質を含まない500マイクロリットルのTCMを新しいウェルに充填し、インサートをこれらの新しいウェルに移します。各インサートの使用済み収集ウェルから培地を別々のラベル付きチューブに回収し、チューブを氷の上に置きます。トランスウェルプレートを時点の間にインキュベーターに戻します。
インサートごとに、異なる時点と渦から収集したメディアを短時間組み合わせます。トラック希釈法を用いて採取した培地をLBオーガープレート上にプレートし、実験の最初の2時間におけるトランスサイトーゼの細菌数を定量化した。4 時間後と 6 時間後にメディアを収集します。
さらに、6時間後に、コントロールウェルから培地をプレートします。6時間で、TEERを測定して記録します。一晩インキュベーションした後、トラック希釈LBプレート上で細菌コロニーを手動でカウントします。
無菌T84細胞の増殖中、T84単層全体のTEERは時間の経過とともに継続的に上昇し、播種から約7日後に平方センチメートルあたり1000OMを超えます。経時的な新生児大腸菌分離株のトランスサイトーシスがここに示されています。平均トランスサイトーシス値の比較は、感染後2時間で新生児大腸菌分離株1対2の間に有意差を示しました。
対照的に、非病原性大腸菌株DH5アルファは、最小限のトランスサイトーシスを受けた。腸上皮細胞をトランスサイトースする能力が異なる2つの新生児大腸菌臨床分離株による感染前後のTEER結果をここに示します。トランスサイトーシスの速度と量は株によって異なりますが、TEERは、感染していないインサートと比較して、両方の病原性株に感染した後に有意に増加します。
TEER測定を一貫した方法で実行することは、この方法で再現性のある結果を得るために重要です。汚染を避けるために厳格な滅菌技術に従うことも非常に重要です。
