Bu yöntem, polarize intestinal epitel hücreleri boyunca çeşitli eşitlenmiş suşların transsitoz yeteneklerini olgun kavşaklarla karşılaştırmaya izin verir. Bu, kaynakların veya zamanın yoğun kullanımını gerektirmeyen nispeten kolay bir tekniktir ve yenidoğan E.coli invaziv hastalığının patogenezinde önemli bir adımın araştırılmasına izin verir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımda araştırma görevlisi olan Josh Wheatley olacak.
Bir biyogüvenlik kabini içinde çalışan tohum T84 hücreleri, polietilen tereftalat membran hücre kültürüne Transwell ekler. Transwell uçlarını tutmak için tasarlanmış 24 kuyucuklu bir plakada, istenen sayıda toplama kuyusunu bir mililitre doku kültürü ortamı veya TCM ile antibiyotiklerle doldurun. Bu ekleri, antibiyotiklerle 500 mikrolitre TCM'de askıya alınmış bir kez 10 ila beşinci T84 hücreleri ile tohumlayın.
Tohumlamadan yaklaşık 48 saat sonra, tek katmanların birleşip birleşmeye başladığını ışık mikroskobu ile doğrulayın. Tohumlamadan sonra her iki günde bir, OM metre veya EVOM başına bir epitel voltu kullanarak transepitelyal elektrik direncini veya TEER'yi ölçün ve kaydedin. TEER'i ölçmeden önce, elektrik probunu 10 ila 15 dakika boyunca beş mililitre% 70 etanol içine batırarak dekontamine edin.
Probu çıkarın, fazla etanol çalkalayın ve biyogüvenlik kabininin içinde 10 dakika boyunca hava ile kurumasını bekleyin. Kuru dekontamine probu, içinde 500 mikrolitre TCM içeren steril bir ek parçası olan ve içinde antibiyotiklerle birlikte steril bir ek bulunan bir mililitre TCM içeren steril bir kuyuya yerleştirerek EVOM ve probu test edin. EVOM okumasının 200 OM'den az olduğundan emin olun. Daha sonraki direnç hesaplamalarında kullanmak için bu boş değeri kaydedin.
Probu TCM tüpünden antibiyotiklerle çıkarın. Probu, toplama kuyusundaki uzun elektrot ile ilk kesici uca yavaşça indirin. Elektrotun toplama kuyusunun dibine temas etmesine izin verin, ancak epitel tek katmanını ve kesici ucun içindeki kısa elektrodu bozabileceğinden aşağı itmeyin.
Tamamlandığında, probu etanol içinde dekontamine edin. T84 hücreleri içeren her bir uçtan elde edilen her değerden boş direnç değerini çıkarın. Ardından, son TEER ölçümünü elde etmek için her kesici uç için ortaya çıkan direnci her bir kesici ucun alt kısmı ile çarpın.
TEER santimetre kare başına 1000 OM'ye ulaştığında, epitel tek katmanı olgunlaşır ve enfeksiyon tahlilleri için hazırdır. TEER olgunlaştıkça, hücrelere her bir ila iki günde bir taze bir ortam sağlayın. Yeni bir 24 kuyucuklu plakada, her tohumlanmış kesici uç için bir oyuğa antibiyotiklerle bir mililitre TCM ekleyin.
Steril forseps kullanarak, ekleri dikkatlice yeni doldurulmuş kuyucuklara aktarın. Kesici uçlardaki ortamı değiştirin. Plakayı eğerek eski ortamı kesici uçlardan çıkarın ve kesici ucun yan tarafında bir pipet ucu bulunan ortamı nazikçe çıkarın.
Eklere 500 mikrolitre antibiyotikli TCM ekleyin ve bozulmadan kaldığını doğrulamak için tek katmanı görselleştirin. Deneyden bir gün önce, TEER'i ölçün ve kaydedin. Ortamı, plakada antibiyotik olmadan bir mililitre TCM ve kesici uçta 500 mikrolitre ile değiştirin.
Beş mililitre steril lizojen et suyu veya LB içeren etiketli 15 mililitrelik konik bir tüp alın ve suyu bir Escherichia coli suşundan bir koloni ile aşılamak için steril bir yağlama kullanın. Tüpün kapağı gevşetilerek kültürü gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, gece LB kültüründen 250 mikrolitreyi, 50 mililitrelik konik bir tüpte antibiyotiksiz 25 mililitre TCM'ye ekleyin.
Tüpü iki saat boyunca inkübe edin. TEER'yi her kesici uç boyunca ölçün. Bunları T'den sıfır saate kadar olan sürede TEER olarak kaydedin.
Kesici uçları yeni bir plakadaki kuyucuklara taşıyın ve ortamı değiştirin. Yeni toplama kuyularını 500 mikrolitre ve kesici uçları el antibiyotikleri olmadan 400 mikrolitre TCM ile doldurun. Ekleri enfeksiyon zamanına kadar doku kültürü inkübatörünün içinde tutun.
İki saat sonra, sabah bakteri kültürlerini çalkalayıcıdan ve santrifüjden çıkarın. Pelet'i TCM'de antibiyotik olmadan yeniden askıya alın. Daha sonra optik yoğunluğu veya OD'yi 0.7 veya 0.9'a ayarlamak için bir spektrofotometre kullanın ve mililitre başına 1 milyon koloni oluşturma birimi veya CFU konsantrasyonuna kadar seyreltin.
Her bir kesici ucu 100 mikrolitre OD ayarlı inokülüm ile enfekte edin. Saati not edin ve zaman sıfır saat olarak kaydedin. İnokulum bakteriyel süspansiyonunu, kare bir LB burgu plakası üzerine 10 mikrolitre aliquot kaplayan iz seyreltme yöntemini kullanarak mililitre başına CFU miktarına yerleştirin.
Aşılamayı takip eden her 30 dakikada bir, yeni kuyucukları antibiyotiksiz 500 mikrolitre TCM ile doldurun ve ekleri bu yeni kuyucuklara aktarın. Her bir uç için kullanılan toplama kuyusundan medyayı ayrı bir etiketli tüpe toplayın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Transwell plakasını zaman noktaları arasında inkübatöre geri koyun.
Her kesici uç için, toplanan medyayı farklı zaman noktalarından ve vorteksten kısaca birleştirin. Deneyin ilk iki saatinde bakteri transsitoz sayısını ölçmek için iz seyreltme yöntemini kullanarak LB burgu plakaları üzerinde toplanan medyayı plakalayın. Medyayı dört ve altı saatte toplayın.
Ek olarak, altı saatte, medyayı kontrol kuyularından plakalayın. Altı saatte, TEER'i ölçün ve kaydedin. Gece boyunca inkübasyondan sonra, bakteri kolonilerini ray seyreltme LB plakaları üzerinde manuel olarak sayın.
Steril T84 hücrelerinin çoğalması sırasında, T84 monokatmanlarındaki TEER'ler zamanla sürekli olarak yükselir ve tohumlamadan yaklaşık yedi gün sonra santimetre kare başına 1000 OM'yi aşar. Yenidoğan E.coli izolatlarının zaman içindeki transsitozu burada gösterilmiştir. Ortalama transsitoz değerlerinin karşılaştırılması, yenidoğan E.coli izolatları arasında enfeksiyondan iki saat sonra bire karşı iki arasında anlamlı farklılıklar olduğunu göstermiştir.
Buna karşılık, patojenik olmayan E.coli suşu DH5 alfa minimal transsitoz geçirdi. İntestinal epitel hücrelerini transsitoza uğratmak için farklı yeteneklere sahip iki yenidoğan E.coli klinik izolatı ile enfeksiyon öncesi ve sonrası TEER sonuçları burada gösterilmiştir. Transsitoz oranı ve miktarı suşlar arasında değişir, ancak TEER, enfekte olmayan eklere kıyasla her iki patojenik suşla enfeksiyondan sonra önemli ölçüde artar.
TEER ölçümlerinin tutarlı bir şekilde yapılması, bu yöntemle tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için çok önemlidir. Kontaminasyonu önlemek için sıkı steril tekniklerin izlenmesi de çok önemlidir.
