Cette méthode permet de comparer les capacités de transcytose de diverses souches égalisées à travers des cellules épithéliales intestinales polarisées avec des jonctions matures. Il s’agit d’une technique relativement simple qui ne nécessite pas beaucoup de ressources ou de temps, et qui permet d’étudier une étape importante dans la pathogenèse de la maladie invasive néonatale à E. coli. Josh Wheatley, un assistant de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.
En travaillant à l’intérieur d’une armoire de biosécurité, ensemencer des cellules T84 dans une culture cellulaire membranaire de polyéthylène téréphtalate Transwell inserts. Dans une plaque de 24 puits conçue pour contenir les inserts Transwell, remplissez le nombre souhaité de puits collecteurs avec un millilitre de milieu de culture tissulaire ou de MTC avec des antibiotiques. Ensemencer ces inserts avec une fois 10 à la cinquième des cellules T84 en suspension dans 500 microlitres de MTC avec des antibiotiques.
Environ 48 heures après l’ensemencement, vérifier par microscopie optique si les monocouches ont commencé à devenir confluentes. Tous les deux jours après l’ensemencement, mesurer et enregistrer la résistance électrique transépithéliale ou TEER à l’aide d’un volt épithélial par OM mètre ou EVOM. Avant de mesurer le TEER, décontaminez la sonde électrique en la plongeant dans cinq millilitres d’éthanol à 70% pendant 10 à 15 minutes.
Retirez la sonde, secouez l’excès d’éthanol et laissez-la sécher à l’air libre à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité pendant 10 minutes. Testez l’EVOM et la sonde en plaçant la sonde sèche décontaminée dans un puits stérile contenant un millilitre de MTC avec des antibiotiques avec un insert stérile à l’intérieur contenant 500 microlitres de MTC avec des antibiotiques. Assurez-vous que la lecture EVOM est inférieure à 200 OM. Enregistrez cette valeur vide pour l’utiliser dans les calculs de résistance ultérieurs.
Retirez la sonde du tube de MTC avec des antibiotiques. Abaissez doucement la sonde dans le premier insert avec la longue électrode dans le puits collecteur. Laissez l’électrode toucher le fond du puits collecteur, mais ne poussez pas vers le bas car cela pourrait perturber la monocouche épithéliale et l’électrode courte à l’intérieur de l’insert.
Lorsque vous avez terminé, décontaminez la sonde dans l’éthanol. Soustrayez la valeur de résistance à blanc de chaque valeur obtenue à partir de chaque insert contenant des cellules T84. Multipliez ensuite la résistance résultante pour chaque insert par la surface du fond de chaque insert pour obtenir la mesure TEER finale.
Une fois que le TEER atteint 1000 OM par centimètre carré, la monocouche épithéliale est mature et prête pour les tests d’infection. Au fur et à mesure que le TEER mûrit, fournissez aux cellules un milieu frais tous les un à deux jours. Dans une nouvelle plaque de 24 puits, ajouter un millilitre de MTC avec des antibiotiques à un puits pour chaque insert ensemencé.
À l’aide de pinces stériles, transférez soigneusement les inserts dans les puits nouvellement réapprovisionnés. Remplacez le support dans les inserts. Retirez l’ancien support des inserts en inclinant la plaque et retirez délicatement le support à l’aide d’une pointe de pipette le long du côté de l’insert.
Ajoutez 500 microlitres de MTC avec des antibiotiques aux inserts et visualisez la monocouche pour vérifier qu’elle reste intacte. La veille de l’expérience, mesurez et enregistrez le TEER. Remplacez le milieu par un millilitre de MTC sans antibiotiques dans le puits de la plaque et 500 microlitres dans l’insert.
Prenez un tube conique marqué de 15 millilitres avec cinq millilitres de bouillon de lysogénie stérile ou LB, et utilisez un lubrifiant stérile pour inoculer le bouillon avec une colonie d’une souche d’Escherichia coli. Incuber la culture pendant la nuit avec le bouchon du tube desserré. Le lendemain, ajoutez 250 microlitres de culture LB pendant la nuit à 25 millilitres de MTC sans antibiotiques dans un tube conique de 50 millilitres.
Incuber le tube pendant deux heures. Mesurez le TEER sur chaque insert. Enregistrez-les en tant que TEER au temps T à zéro heure.
Déplacez les inserts vers des puits dans une nouvelle plaque et changez le support. Remplissez les nouveaux puits collecteurs avec 500 microlitres et les inserts avec 400 microlitres de MTC sans antibiotiques pour les mains. Conservez les inserts à l’intérieur de l’incubateur de culture tissulaire jusqu’au moment de l’infection.
Après deux heures, retirez les cultures bactériennes du matin de l’agitateur et de la centrifugeuse. Remettez en suspension la pastille en MTC sans antibiotiques. Ensuite, utilisez un spectrophotomètre pour ajuster la densité optique ou OD à 0,7 ou 0,9 et diluez davantage à une concentration de 1 million d’unités formant colonie ou UFC par millilitre.
Infectez chaque insert avec 100 microlitres de l’inoculum ajusté OD. Notez l’heure et enregistrez-la comme heure zéro. Placer la suspension bactérienne d’inoculum à la quantité d’UFC par millilitre en utilisant la méthode de dilution de la piste en plaquant 10 microlitres aliquote sur une plaque de tarière LB carrée.
Toutes les 30 minutes suivant l’inoculation, remplir les nouveaux puits avec 500 microlitres de MTC sans antibiotiques et transférer les inserts dans ces nouveaux puits. Recueillir le média du puits collecteur utilisé pour chaque insert dans un tube étiqueté séparé et placer le tube sur de la glace. Remettez la plaque Transwell dans l’incubateur entre les points temporels.
Pour chaque insertion, combinez brièvement les supports collectés à partir de différents points temporels et vortex. Plaquer les milieux collectés sur des plaques de vis sans fin LB en utilisant la méthode de dilution de piste pour quantifier le nombre de bactéries transcysées au cours des deux premières heures de l’expérience. Collectez les médias à quatre et six heures.
De plus, à six heures, plaquez le média des puits de contrôle. À six heures, mesurer et enregistrer le TEER. Après une nuit d’incubation, compter manuellement les colonies bactériennes sur les plaques LB de dilution de piste.
Au cours de la prolifération des cellules T84 stériles, les TEER à travers les monocouches T84 augmentent continuellement au fil du temps, dépassant 1000 OM par centimètre carré environ sept jours après l’ensemencement. La transcytose des isolats néonatals d’E. coli au fil du temps est illustrée ici. Les comparaisons des valeurs moyennes de transcytose ont montré des différences significatives entre les isolats néonatals d’E. coli un et deux deux heures après l’infection.
En revanche, la souche DH5 alpha non pathogène d’E. coli a subi une transcytose minimale. Les résultats TEER avant et après l’infection par deux isolats cliniques néonatals d’E. coli ayant des capacités différentes pour transcyter les cellules épithéliales intestinales sont présentés ici. Le taux et la quantité de transcytose varient selon les souches, mais le TEER augmente significativement après l’infection par les deux souches pathogènes par rapport aux inserts non infectés.
Effectuer des mesures TEER de manière cohérente est crucial pour obtenir des résultats reproductibles avec cette méthode. Il est également très important de suivre des techniques stériles strictes pour éviter la contamination.
