이 방법을 사용하면 분극화 된 장 상피 세포와 성숙한 접합부에 걸쳐 다양한 균등화 된 균주의 transcytosis 능력을 비교할 수 있습니다. 이것은 자원이나 시간의 광범위한 사용을 필요로하지 않는 비교적 쉬운 기술이며, 신생아 대장균 침습성 질환의 발병 기전에서 중요한 단계를 조사 할 수있게합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 조교 인 Josh Wheatley가 될 것입니다.
생물안전 캐비닛 내부에서 작업하면서 T84 세포를 폴리에틸렌 테레프탈레이트 멤브레인 세포 배양 Transwell 삽입물에 시드합니다. Transwell 삽입물을 고정하도록 설계된 24웰 플레이트에서 원하는 수의 수집 웰을 1밀리리터의 조직 배양 배지 또는 항생제가 함유된 TCM으로 채웁니다. 이들 삽입물을 500 마이크로리터의 TCM에 현탁된 5번째 T84 세포에 1회 10회 시드하고 항생제로 한다.
파종 후 약 48시간 후에 단층이 합류하기 시작했는지 광학 현미경으로 확인합니다. 파종 후 2일마다, OM 미터 또는 EVOM 당 상피 볼트를 사용하여 경상피 전기 저항 또는 TEER을 측정하고 기록한다. TEER을 측정하기 전에 전기 프로브를 70 % 에탄올 5 밀리리터에 10-15 분 동안 담가 오염을 제거하십시오.
프로브를 제거하고 여분의 에탄올을 털어 내고 생물 안전 캐비닛 내부에서 10 분 동안 자연 건조시킵니다. 항생제가 포함된 500마이크로리터의 TCM이 포함된 멸균 삽입물이 있는 항생제가 포함된 TCM 1밀리리터가 들어 있는 멸균 웰에 건식 오염 제거 프로브를 배치하여 EVOM 및 프로브를 테스트합니다. EVOM 판독값이 200OM 미만인지 확인합니다. 이 빈 값을 기록하여 나중에 저항 계산에 사용할 수 있습니다.
항생제로 TCM 튜브에서 프로브를 제거하십시오. 프로브를 수집 웰의 긴 전극이있는 첫 번째 인서트로 부드럽게 내립니다. 전극이 수집 우물의 바닥에 닿도록 하되 인서트 내부의 상피 단층과 짧은 전극을 방해할 수 있으므로 아래로 누르지 마십시오.
완료되면 에탄올에서 프로브의 오염을 제거하십시오. T84 셀을 포함하는 각 삽입물에서 얻은 각 값에서 블랭크 저항 값을 뺍니다. 그런 다음 각 인서트에 대한 결과 저항에 각 인서트의 바닥 면적을 곱하여 최종 TEER 측정값을 얻습니다.
TEER이 평방 센티미터당 1000OM에 도달하면 상피 단층이 성숙하고 감염 분석을 위한 준비가 됩니다. TEER이 성숙함에 따라, 세포에 1 내지 2일마다 새로운 배지를 제공한다. 새로운 24웰 플레이트에서 항생제가 포함된 TCM 1밀리리터를 시드된 각 삽입물에 대해 하나의 웰에 추가합니다.
멸균 포셉을 사용하여 인서트를 새로 보충 된 우물로 조심스럽게 옮깁니다. 삽입물의 용지를 교체합니다. 플레이트를 기울여 인서트에서 기존 미디어를 제거하고 인서트 측면을 따라 피펫 팁으로 미디어를 부드럽게 제거합니다.
항생제와 함께 500마이크로리터의 TCM을 삽입물에 추가하고 단층을 시각화하여 손상되지 않았는지 확인합니다. 실험 전날, TEER을 측정하고 기록하였다. 배지를 플레이트 웰에 항생제가없는 TCM 1 밀리리터로, 삽입물에 500 마이크로 리터로 교체하십시오.
5 밀리리터의 멸균 리소제닉 브로스 또는 LB가 포함 된 라벨이 붙은 15 밀리리터 원추형 튜브를 가져 와서 멸균 윤활유를 사용하여 하나의 Escherichia coli 균주에서 하나의 콜로니를 국물에 접종합니다. 튜브의 뚜껑을 풀고 밤새 배양하십시오. 다음날, 50 밀리리터 원추형 튜브에 항생제가없는 25 밀리리터의 TCM에 밤새 LB 배양에서 250 마이크로 리터를 추가합니다.
튜브를 2 시간 동안 배양하십시오. 각 인서트에서 TEER을 측정합니다. 이를 T에서 0 시간까지의 TEER로 기록하십시오.
인서트를 새 플레이트의 웰로 옮기고 매체를 교체하십시오. 새로운 수집 웰을 500 마이크로 리터로 채우고 손 항생제없이 400 마이크로 리터의 TCM으로 삽입물을 채 웁니다. 감염 될 때까지 조직 배양 인큐베이터 내부에 삽입물을 보관하십시오.
2 시간 후, 아침 박테리아 배양 물을 쉐이커 및 원심 분리기에서 꺼냅니다. 항생제 없이 TCM에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 분광 광도계를 사용하여 광학 밀도 또는 OD를 0.7 또는 0.9로 조정하고 밀리리터당 100만 콜로니 형성 단위 또는 CFU 농도로 추가로 희석합니다.
각 삽입물을 100 마이크로리터의 OD 조정 접종물로 감염시킨다. 시간을 기록하고 시간 0 시간으로 기록합니다. 정사각형 LB 오거 플레이트에 10 마이크로리터 분취량을 도금하는 트랙 희석 방법을 사용하여 밀리리터당 CFU의 양으로 접종 박테리아 현탁액을 놓습니다.
접종 후 30 분마다 항생제가없는 500 마이크로 리터의 TCM으로 새 우물을 채우고 삽입물을이 새로운 우물로 옮깁니다. 각 삽입물에 대해 사용된 수집 웰에서 배지를 별도의 라벨이 붙은 튜브에 수집하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 트랜스웰 플레이트를 시점 사이의 인큐베이터로 되돌립니다.
각 삽입물에 대해 서로 다른 시점과 와류에서 수집 된 미디어를 간단히 결합하십시오. 수집된 배지를 트랙 희석 방법을 사용하여 LB 오거 플레이트에 플레이팅하여 실험의 처음 2시간 동안 박테리아 트랜스사이토제의 수를 정량화했습니다. 4 시간 및 6 시간에 미디어를 수집하십시오.
추가적으로, 6시간에, 대조군 웰로부터 배지를 플레이트화한다. 6시간에, TEER을 측정하고 기록한다. 하룻밤 배양 후, 트랙 희석 LB 플레이트에서 박테리아 콜로니를 수동으로 계수한다.
멸균 T84 세포가 증식하는 동안 T84 단층을 가로지르는 TEER은 시간이 지남에 따라 지속적으로 상승하여 파종 후 약 7일 후에 평방 센티미터당 1000OM을 초과합니다. 시간이 지남에 따라 신생아 E.coli의 분리 물의 트랜스사이토시스가 여기에 표시됩니다. 평균 트랜스사이토시스 값의 비교는 감염 후 2시간에 1대 2를 분리한 신생아 대장균 사이에 유의미한 차이를 보여주었습니다.
대조적으로, 비병원성 E.coli 균주 DH5 알파는 최소한의 트랜스사이토시스를 겪었습니다. 장 상피 세포를 형질전환하는 능력이 다른 두 개의 신생아 대장균 임상 분리물에 대한 감염 전후의 TEER 결과가 여기에 표시됩니다. 트랜스사이토시스의 비율과 양은 균주마다 다르지만 TEER은 감염되지 않은 삽입물에 비해 두 병원성 균주에 감염된 후 유의하게 증가합니다.
일관된 방식으로 TEER 측정을 수행하는 것은 이 방법으로 재현 가능한 결과를 얻는 데 중요합니다. 오염을 피하기 위해 엄격한 멸균 기술을 따르는 것도 매우 중요합니다.
