Este método permite comparar as habilidades de transcitose de várias cepas equalizadas através de células epiteliais intestinais polarizadas com junções maduras. Esta é uma técnica relativamente fácil que não requer uso extensivo de recursos ou tempo, e permite investigar um passo importante na patogênese da doença invasiva neonatal de E.coli. Demonstrando o procedimento estará Josh Wheatley, um assistente de pesquisa no meu laboratório.
Trabalhando dentro de um gabinete de biossegurança, as células T84 de sementes em polietileno tereftalato de membrana de cultura de células Transwell inserem. Em uma placa de 24 poços projetada para conter inserções Transwell, preencha o número desejado de poços coletores com um mililitro de meio de cultura de tecidos ou MTC com antibióticos. Semeia estas inserções com uma vez 10 para a quinta células T84 suspensas em 500 microlitros de MTC com antibióticos.
Aproximadamente 48 horas após a semeadura, verifique com microscopia de luz se as monocamadas começaram a se tornar confluentes. A cada dois dias após a semeadura, medir e registrar a resistência elétrica transepitelial ou TEER usando um volt epitelial por medidor OM ou EVOM. Antes de medir o TEER, descontamine a sonda elétrica submergindo-a em cinco mililitros de etanol a 70% por 10 a 15 minutos.
Retire a sonda, agite o excesso de etanol e deixe secar ao ar dentro do gabinete de biossegurança por 10 minutos. Teste o EVOM e a sonda colocando a sonda seca descontaminada em um poço estéril contendo um mililitro de MTC com antibióticos com uma inserção estéril no interior contendo 500 microlitros de MTC com antibióticos. Certifique-se de que a leitura EVOM seja inferior a 200 OM. Registre esse valor em branco para usá-lo nos cálculos de resistência posteriores.
Remova a sonda do tubo de MTC com antibióticos. Abaixe suavemente a sonda na primeira inserção com o eletrodo longo no poço coletor. Permita que o eletrodo toque o fundo do poço coletor, mas não empurre para baixo, pois isso pode interromper a monocamada epitelial e o eletrodo curto dentro da inserção.
Quando terminar, descontamine a sonda no etanol. Subtraia o valor de resistência em branco de cada valor obtido de cada inserção que contenha células T84. Em seguida, multiplique a resistência resultante para cada inserção pela área do fundo de cada pastilha para obter a medição final do TEER.
Uma vez que o TEER atinge 1000 OMs por centímetro quadrado, a monocamada epitelial está madura e pronta para ensaios de infecção. À medida que o TEER amadurece, forneça às células um meio fresco a cada um a dois dias. Em uma nova placa de 24 poços, adicione um mililitro de MTC com antibióticos a um poço para cada inserção semeada.
Usando pinças estéreis, transfira cuidadosamente as inserções para os poços recém-reabastecidos. Substitua a mídia nas inserções. Remova a mídia antiga das inserções inclinando a placa e remova cuidadosamente a mídia com uma ponta de pipeta ao longo do lado da pastilha.
Adicione 500 microlitros de MTC com antibióticos às pastilhas e visualize a monocamada para verificar se ela permanece intacta. No dia anterior ao experimento, meça e registre o TEER. Substitua o meio por um mililitro de MTC sem antibióticos no poço da placa e 500 microlitros na inserção.
Pegue um tubo cônico rotulado de 15 mililitros com cinco mililitros de caldo de lisogenia estéril ou LB e use um lubrificante estéril para inocular o caldo com uma colônia de uma cepa de Escherichia coli. Incubar a cultura durante a noite com a tampa do tubo solta. No dia seguinte, adicione 250 microlitros da cultura LB durante a noite a 25 mililitros de MTC sem antibióticos em um tubo cônico de 50 mililitros.
Incube o tubo por duas horas. Meça o TEER em cada inserção. Registre-os como os TEERs no momento T até a hora zero.
Mova as inserções para poços em uma nova placa e mude a mídia. Encha os novos poços coletores com 500 microlitros e inserções com 400 microlitros de MTC sem antibióticos manuais. Mantenha as inserções dentro da incubadora de cultura de tecidos até o momento da infecção.
Após duas horas, remova as culturas bacterianas matinais do agitador e da centrífuga. Ressuspenda o pellet na MTC sem antibióticos. Em seguida, use um espectrofotômetro para ajustar a densidade óptica ou OD para 0,7 ou 0,9 e diluir ainda mais para uma concentração de 1 milhão de unidades formadoras de colônias ou UFC por mililitro.
Infecte cada inserção com 100 microlitros do inóculo ajustado por OD. Anote a hora e registre-a como hora zero. Coloque a suspensão bacteriana de inóculo na quantidade CFU por mililitro usando o método de diluição da via chapeando alíquota de 10 microlitros em uma placa de trado LB quadrada.
A cada 30 minutos após a inoculação, encha novos poços com 500 microlitros de MTC sem antibióticos e transfira as inserções para esses novos poços. Recolha o meio do poço colector utilizado para cada inserção num tubo separado rotulado e coloque o tubo no gelo. Devolva a placa Transwell à incubadora entre os pontos de tempo.
Para cada inserção, combine a mídia coletada de diferentes pontos de tempo e vórtice brevemente. Chapear o meio coletado em placas de trado LB utilizando o método de diluição da via para quantificar o número de transcitose bacteriana nas duas primeiras horas do experimento. Recolha os meios de comunicação às quatro e seis horas.
Além disso, às seis horas, chapear o meio dos poços de controle. Às seis horas, meça e registre o TEER. Após a incubação durante a noite, conte as colônias bacterianas manualmente nas placas LB de diluição da trilha.
Durante a proliferação das células T84 estéreis, os TEERs através das monocamadas T84 aumentam continuamente ao longo do tempo, ultrapassando 1000 OMs por centímetro quadrado aproximadamente após sete dias da semeadura. A transcitose de isolados neonatais de E.coli ao longo do tempo é mostrada aqui. As comparações dos valores médios de transcitose demonstraram diferenças significativas entre os isolados neonatais de E.coli um versus dois em duas horas após a infecção.
Em contraste, a cepa não patogênica de E.coli DH5 alfa foi submetida a transcitose mínima. Os resultados do TEER antes e após a infecção com dois isolados clínicos neonatais de E.coli com diferentes habilidades para transcitose células epiteliais intestinais são mostrados aqui. A taxa e a quantidade de transcitose variam entre as cepas, mas o TEER aumenta significativamente após a infecção com ambas as cepas patogênicas em comparação com as inserções não infectadas.
Realizar medições de TEER de forma consistente é crucial para a obtenção de resultados reprodutíveis com este método. Seguir técnicas estéreis rigorosas para evitar a contaminação também é muito importante.
