新生儿 大肠杆菌 分离菌血症肠道转吞作用的评估

该方法允许比较具有成熟连接的极化肠上皮细胞上各种均衡菌株的转吞能力。这是一种相对简单的技术，不需要大量使用资源或时间，并且可以研究新生儿大肠杆菌侵袭性疾病发病机制的重要步骤。演示该程序的将是我实验室的研究助理Josh Wheatley。

在生物安全柜内工作，将T84细胞接种到聚对苯二甲酸乙二醇酯膜细胞培养物Transwell插入物中。在设计用于容纳Transwell插入物的24孔板中，用一毫升组织培养基或抗生素中药填充所需数量的收集孔。将这些插入物接种1倍10至第五个T84细胞，悬浮在500微升中药和抗生素中。

接种后约48小时，用光学显微镜验证单层是否开始汇合。接种后每两天，使用每OM计或EVOM的上皮伏特测量并记录跨上皮电阻或TEER。在测量TEER之前，通过将电探针浸入5毫升70%乙醇中10至15分钟来净化电探针。

取下探针，甩掉多余的乙醇，让它在生物安全柜内风干10分钟。通过将干燥的去污探针放入含有1毫升中药和抗生素的无菌孔中，并在含有500微升中药和抗生素的无菌插入物中来测试EVOM和探针。确保 EVOM 读数小于 200 OM。记录此空白值，以便在以后的电阻计算中使用它。

用抗生素从中医管中取出探针。用收集孔中的长电极轻轻地将探头降低到第一个插入物中。让电极接触收集孔的底部，但不要向下推，因为这可能会破坏插入物内的上皮单层和短电极。

完成后，对乙醇中的探针进行净化。从每个包含T84细胞的插入物获得的每个值中减去空白电阻值。然后将每个刀片的电阻乘以每个刀片底部的面积，以获得最终的TEER测量值。

一旦TEER达到每平方厘米1000 OM，上皮单层就成熟并准备好进行感染测定。随着TEER的成熟，每隔一到两天为细胞提供新鲜的培养基。在新的 24 孔板中，为每个种子插入物向一个孔中加入一毫升中药和抗生素。

使用无菌镊子，小心地将插入物转移到新补充的孔中。更换插入件中的介质。通过倾斜板从插入物中取出旧介质，然后沿插入物侧面用移液器吸头轻轻取出介质。

在插入物中加入500微升含有抗生素的中药，并观察单层以验证其是否保持完整。实验前一天，测量并记录TEER。在板孔中用一毫升不含抗生素的中药替换培养基，并在插入物中用500微升替换培养基。

取一个标记的 15 毫升锥形管，里面装有 5 毫升无菌溶原肉汤或 LB，并使用无菌润滑油用一种大肠杆菌菌株的一个菌落接种肉汤。将培养物孵育过夜，松开管中的盖子。第二天，在50毫升锥形管中将250微升过夜LB培养物加入25毫升不含抗生素的中药中。

将试管孵育两个小时。测量每个刀片的TEER。将这些记录为时间 T 到零小时的 TEER。

将插入物移动到新板中的孔中并更换培养基。用500微升填充新的收集孔，并用400微升不含手抗生素的中药插入物。将插入物保持在组织培养箱内，直到感染。

两个小时后，从摇床和离心机中取出早晨的细菌培养物。将沉淀重悬于不含抗生素的中药中。然后使用分光光度计将光密度或OD调节至0.7或0.9，并进一步稀释至每毫升100万个菌落形成单位或CFU的浓度。

用100微升OD调整的接种物感染每个插入物。记下时间并将其记录为时间零小时。使用轨道稀释法将接种物细菌悬浮液置于每毫升的CFU量，将10微升等分试样铺在方形LB螺旋钻板上。

接种后每30分钟，用500微升不含抗生素的中药填充新孔，并将插入物转移到这些新孔中。将每个插入物的用过的收集孔中的培养基收集到单独的标记管中，并将管放在冰上。在时间点之间将Transwell板返回培养箱。

对于每个插入，合并来自不同时间点的收集介质并短暂涡旋。使用跟踪稀释法将收集的培养基铺在LB螺旋板上，以量化实验前两个小时内细菌转胞酶的数量。在四六个小时收集媒体。

此外，在六小时时，从对照孔中铺上培养基。在六小时时，测量并记录TEER。孵育过夜后，在跟踪稀释LB板上手动计数细菌菌落。

在无菌T84细胞增殖期间，T84单层的TEER随着时间的推移不断上升，在接种后约7天后每平方厘米超过1000 OM。此处显示了新生儿大肠杆菌分离株随时间推移的转吞作用。平均转吞值的比较表明，在感染后两小时内，新生儿大肠杆菌分离株1与2大肠杆菌分离株之间存在显着差异。

相比之下，非致病性大肠杆菌菌株DH5α经历了最小的转吞作用。本文显示了两种具有不同肠上皮细胞转胞能力的新生儿大肠杆菌临床分离株感染前后的TEER结果。转吞的速率和量因菌株而异，但与未感染的插入物相比，感染两种致病菌株后 TEER 显着增加。

以一致的方式进行TEER测量对于使用此方法获得可重复的结果至关重要。遵循严格的无菌技术以避免污染也非常重要。