Este método permite comparar las capacidades de transcitosis de varias cepas igualadas a través de células epiteliales intestinales polarizadas con uniones maduras. Esta es una técnica relativamente fácil que no requiere un uso extensivo de recursos o tiempo, y permite investigar un paso importante en la patogénesis de la enfermedad invasiva neonatal de E. coli. Demostrando el procedimiento estará Josh Wheatley, un asistente de investigación en mi laboratorio.
Trabajando dentro de un gabinete de bioseguridad, siembre células T84 en cultivos celulares de membrana de tereftalato de polietileno Transwell insertos. En una placa de 24 pocillos diseñada para contener insertos Transwell, llene el número deseado de pocillos colectores con un mililitro de medio de cultivo de tejidos o MTC con antibióticos. Siembre estos insertos con una vez 10 a la quinta células T84 suspendidas en 500 microlitros de MTC con antibióticos.
Aproximadamente 48 horas después de la siembra, verifique con microscopía óptica si las monocapas han comenzado a confluir. Cada dos días después de la siembra, mida y registre la resistencia eléctrica transepitelial o TEER utilizando un voltio epitelial por metro OM o EVOM. Antes de medir el TEER, descontamine la sonda eléctrica sumergiéndola en cinco mililitros de etanol al 70% durante 10 a 15 minutos.
Retire la sonda, sacuda el exceso de etanol y déjela secar al aire dentro del gabinete de bioseguridad durante 10 minutos. Pruebe el EVOM y la sonda colocando la sonda seca descontaminada en un pocillo estéril que contenga un mililitro de MTC con antibióticos con un inserto estéril en el interior que contenga 500 microlitros de MTC con antibióticos. Asegúrese de que la lectura del EVOM sea inferior a 200 OM. Registre este valor en blanco para usarlo en los cálculos de resistencia posteriores.
Retire la sonda del tubo de MTC con antibióticos. Baje suavemente la sonda en el primer inserto con el electrodo largo en el pozo colector. Permita que el electrodo toque el fondo del pocillo colector, pero no empuje hacia abajo, ya que esto puede interrumpir la monocapa epitelial y el electrodo corto dentro del inserto.
Cuando termine, descontamine la sonda en el etanol. Reste el valor de resistencia en blanco de cada valor obtenido de cada inserto que contenga celdas T84. Luego multiplique la resistencia resultante para cada inserto por el área de la parte inferior de cada inserto para obtener la medición TEER final.
Una vez que el TEER alcanza los 1000 OM por centímetro cuadrado, la monocapa epitelial está madura y lista para los ensayos de infección. A medida que el TEER madura, proporcione a las células un medio fresco cada uno o dos días. En una nueva placa de 24 pocillos, agregue un mililitro de MTC con antibióticos a un pocillo por cada inserto con semillas.
Usando fórceps estériles, transfiera cuidadosamente los insertos a los pozos recién reabastecidos. Reemplace el soporte en las inserciones. Retire el medio viejo de los insertos inclinando la placa y retire suavemente el medio con una punta de pipeta a lo largo del costado del inserto.
Agregue 500 microlitros de MTC con antibióticos a los insertos y visualice la monocapa para verificar que permanezca intacta. El día antes del experimento, mide y registra el TEER. Reemplace el medio con un mililitro de MTC sin antibióticos en el pozo de la placa y 500 microlitros en el inserto.
Tome un tubo cónico de 15 mililitros etiquetado con cinco mililitros de caldo de lisogenia estéril o LB, y use un lubricante estéril para inocular el caldo con una colonia de una cepa de Escherichia coli. Incubar el cultivo durante la noche con la tapa del tubo aflojada. Al día siguiente, agregue 250 microlitros de cultivo LB durante la noche a 25 mililitros de MTC sin antibióticos en un tubo cónico de 50 mililitros.
Incubar el tubo durante dos horas. Mida el TEER en cada inserto. Regístrelos como los TEER en el momento T a la hora cero.
Mueva los insertos a pozos en una placa nueva y cambie el medio. Llene los nuevos pocillos colectores con 500 microlitros e insertos con 400 microlitros de MTC sin antibióticos manuales. Mantenga los insertos dentro de la incubadora de cultivo de tejidos hasta el momento de la infección.
Después de dos horas, retire los cultivos bacterianos matutinos del agitador y la centrífuga. Resuspender el pellet en MTC sin antibióticos. Luego use un espectrofotómetro para ajustar la densidad óptica o OD a 0.7 o 0.9 y diluya aún más a una concentración de 1 millón de unidades formadoras de colonias o UFC por mililitro.
Infecte cada inserto con 100 microlitros del inóculo ajustado a OD. Anote la hora y regístrela como hora cero. Colocar la suspensión bacteriana del inóculo a la cantidad de UFC por mililitro utilizando el método de dilución de vía que cubre la alícuota de 10 microlitros en una placa de barrena LB cuadrada.
Cada 30 minutos después de la inoculación, llene los nuevos pocillos con 500 microlitros de MTC sin antibióticos y transfiera los insertos a estos nuevos pocillos. Recoja los medios del pozo recolector usado para cada inserto en un tubo etiquetado separado y coloque el tubo sobre hielo. Devuelva la placa Transwell a la incubadora entre puntos de tiempo.
Para cada inserto, combine brevemente los medios recopilados de diferentes puntos de tiempo y vórtice. Platear los medios recolectados en placas de barrena LB utilizando el método de dilución de pista para cuantificar el número de bacterias transcitosas en las primeras dos horas del experimento. Recoja los medios a las cuatro y seis horas.
Además, a las seis horas, coloque los medios de los pozos de control. A las seis horas, medir y registrar el TEER. Después de la incubación durante la noche, cuente las colonias bacterianas manualmente en las placas LB de dilución de pista.
Durante la proliferación de las células T84 estériles, los TEER a través de las monocapas T84 aumentan continuamente con el tiempo, superando los 1000 OM por centímetro cuadrado aproximadamente después de siete días desde la siembra. Aquí se muestra la transcitosis de aislados neonatales de E. coli a lo largo del tiempo. Las comparaciones de los valores medios de transcitosis demostraron diferencias significativas entre los aislados neonatales de E. coli uno frente a dos a las dos horas posteriores a la infección.
En contraste, la cepa no patógena de E. coli DH5 alfa sufrió una transcitosis mínima. Aquí se muestran los resultados de TEER antes y después de la infección con dos aislados clínicos neonatales de E. coli con diferentes capacidades para transcitar las células epiteliales intestinales. La velocidad y la cantidad de transcitosis varían entre las cepas, pero el TEER aumenta significativamente después de la infección con ambas cepas patógenas en comparación con los insertos no infectados.
Realizar mediciones TEER de manera consistente es crucial para obtener resultados reproducibles con este método. Seguir técnicas estériles estrictas para evitar la contaminación también es muy importante.
