Diese Methode ermöglicht es, die Transzytosefähigkeiten verschiedener ausgeglichener Stämme über polarisierte intestinale Epithelzellen mit reifen Verbindungen zu vergleichen. Dies ist eine relativ einfache Technik, die keinen großen Ressourcen- oder Zeitaufwand erfordert und es ermöglicht, einen wichtigen Schritt in der Pathogenese der neonatalen invasiven E. coli-Erkrankung zu untersuchen. Josh Wheatley, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter in meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren.
In einer Biosicherheitswerkbank werden T84-Zellen in Polyethylenterephthalat-Membran-Zellkultur-Transwell-Einsätze geimpft. In einer 24-Well-Platte, die für die Aufnahme von Transwell-Einsätzen ausgelegt ist, füllen Sie die gewünschte Anzahl von Auffangbecken mit einem Milliliter Gewebekulturmedium oder TCM mit Antibiotika. Säen Sie diese Einsätze mit einmal 10 bis fünften T84-Zellen, die in 500 Mikrolitern TCM mit Antibiotika suspendiert sind.
Etwa 48 Stunden nach der Aussaat wird mit Lichtmikroskopie überprüft, ob die Monoschichten begonnen haben, zu konfluieren. Messen und notieren Sie alle zwei Tage nach der Aussaat den transepithelialen elektrischen Widerstand oder TEER mit einem Epithelvolt pro OM-Meter oder EVOM. Bevor Sie den TEER messen, dekontaminieren Sie die elektrische Sonde, indem Sie sie 10 bis 15 Minuten lang in fünf Milliliter 70%iges Ethanol tauchen.
Entfernen Sie die Sonde, schütteln Sie das überschüssige Ethanol ab und lassen Sie es 10 Minuten lang in der Biosicherheitswerkbank an der Luft trocknen. Testen Sie das EVOM und die Sonde, indem Sie die trockene dekontaminierte Sonde in eine sterile Vertiefung geben, die einen Milliliter TCM mit Antibiotika enthält, mit einem sterilen Einsatz im Inneren, der 500 Mikroliter TCM mit Antibiotika enthält. Stellen Sie sicher, dass der EVOM Messwert weniger als 200 OM beträgt. Notieren Sie diesen leeren Wert, um ihn in den späteren Widerstandsberechnungen zu verwenden.
Entfernen Sie die Sonde mit Antibiotika aus dem Röhrchen der TCM. Senken Sie die Sonde vorsichtig in den ersten Einsatz mit der langen Elektrode in der Auffangmulde. Lassen Sie die Elektrode den Boden der Auffangmulde berühren, aber drücken Sie nicht nach unten, da dies die epitheliale Monoschicht und die kurze Elektrode im Inneren des Einsatzes stören kann.
Wenn Sie fertig sind, dekontaminieren Sie die Sonde im Ethanol. Subtrahieren Sie den Blindwiderstandswert von jedem Wert, der von jedem Einsatz mit T84-Zellen erhalten wird. Multiplizieren Sie dann den resultierenden Widerstand für jeden Einsatz mit der Fläche der Unterseite jedes Einsatzes, um die endgültige TEER-Messung zu erhalten.
Sobald der TEER 1000 OMs pro Quadratzentimeter erreicht, ist die epitheliale Monoschicht ausgereift und bereit für Infektionstests. Wenn das TEER reift, versorgen Sie die Zellen alle ein bis zwei Tage mit einem frischen Medium. In einer neuen 24-Well-Platte fügen Sie einen Milliliter TCM mit Antibiotika zu einer Vertiefung für jede gesäte Einlage hinzu.
Übergeben Sie die Einsätze vorsichtig mit einer sterilen Pinzette in die neu aufgefüllten Vertiefungen. Ersetzen Sie die Medien in den Beilagen. Entfernen Sie das alte Medium aus den Einsätzen, indem Sie die Platte kippen, und entfernen Sie das Medium vorsichtig mit einer Pipettenspitze an der Seite des Einsatzes.
Fügen Sie 500 Mikroliter TCM mit Antibiotika zu den Einsätzen hinzu und visualisieren Sie die Monoschicht, um zu überprüfen, ob sie intakt bleibt. Messen und notieren Sie am Tag vor dem Experiment den TEER. Ersetzen Sie das Medium durch einen Milliliter TCM ohne Antibiotika in der Plattenmulde und 500 Mikroliter in der Einlage.
Nehmen Sie ein markiertes konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern steriler Lysogenie-Bouillon oder LB und verwenden Sie ein steriles Gleitmittel, um die Brühe mit einer Kolonie aus einem Escherichia coli-Stamm zu impfen. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht, wobei die Kappe aus dem Röhrchen gelockert wird. Am nächsten Tag fügen Sie 250 Mikroliter aus der LB-Kultur über Nacht zu 25 Milliliter TCM ohne Antibiotika in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen hinzu.
Inkubieren Sie das Röhrchen für zwei Stunden. Messen Sie den TEER an jedem Einsatz. Notieren Sie diese als TEERs zur Zeit T bis Null Stunde.
Verschieben Sie die Einsätze in Vertiefungen in einer neuen Platte und wechseln Sie das Medium. Füllen Sie die neuen Auffangbrunnen mit 500 Mikrolitern und Einsätze mit 400 Mikrolitern TCM ohne Handantibiotika. Bewahren Sie die Einsätze bis zum Zeitpunkt der Infektion im Gewebekulturinkubator auf.
Entfernen Sie nach zwei Stunden die morgendlichen Bakterienkulturen aus dem Schüttler und der Zentrifuge. Resuspendieren Sie das Pellet in TCM ohne Antibiotika. Verwenden Sie dann ein Spektralphotometer, um die optische Dichte oder den OD auf 0,7 oder 0,9 einzustellen und weiter auf eine Konzentration von 1 Million koloniebildenden Einheiten oder KBE pro Milliliter zu verdünnen.
Infizieren Sie jeden Einsatz mit 100 Mikrolitern des OD-angepassten Inokulums. Notieren Sie sich die Uhrzeit und notieren Sie sie als Zeit Null Stunde. Platzieren Sie die Inokulumbakteriensuspension auf eine Menge KBE pro Milliliter unter Verwendung der Spurverdünnungsmethode, wobei 10 Mikroliter Aliquot auf eine quadratische LB-Schneckenplatte aufgetragen werden.
Füllen Sie alle 30 Minuten nach der Impfung neue Vertiefungen mit 500 Mikrolitern TCM ohne Antibiotika und überführen Sie die Einsätze in diese neuen Vertiefungen. Sammeln Sie das Medium aus der gebrauchten Auffangmulde für jeden Einsatz in ein separates, beschriftetes Röhrchen und legen Sie das Röhrchen auf Eis. Bringen Sie die Transwell-Platte zwischen den Zeitpunkten in den Inkubator zurück.
Kombinieren Sie für jeden Einsatz die gesammelten Medien aus verschiedenen Zeitpunkten und wirbeln Sie kurz. Die gesammelten Medien werden mit der Spurverdünnungsmethode auf LB-Schneckenplatten plattiert, um die Anzahl der Bakterien zu quantifizieren, die in den ersten zwei Stunden des Experiments transzytieren. Sammeln Sie die Medien nach vier und sechs Stunden.
Zusätzlich werden die Medien nach sechs Stunden aus den Kontrollbohrungen plattiert. Messen und notieren Sie nach sechs Stunden den TEER. Nach der Inkubation über Nacht werden die Bakterienkolonien manuell auf den Spurverdünnungs-LB-Platten gezählt.
Während der Vermehrung der sterilen T84-Zellen steigen die TEERs über die T84-Monoschichten im Laufe der Zeit kontinuierlich an und überschreiten etwa sieben Tage nach der Aussaat 1000 OMs pro Quadratzentimeter. Die Transzytose von neonatalen E.coli-Isolaten im Laufe der Zeit wird hier gezeigt. Die Vergleiche der mittleren Transzytosewerte zeigten signifikante Unterschiede zwischen den neonatalen E.coli-Isolaten eins und zwei zwei Stunden nach der Infektion.
Im Gegensatz dazu erfuhr der nicht-pathogene E.coli-Stamm DH5 alpha eine minimale Transzytose. TEER-Ergebnisse vor und nach der Infektion mit zwei neonatalen klinischen E.coli-Isolaten mit unterschiedlichen Fähigkeiten zur Transzytierung von Darmepithelzellen sind hier dargestellt. Die Rate und das Ausmaß der Transzytose variieren zwischen den Stämmen, aber die TEER steigt nach einer Infektion mit beiden pathogenen Stämmen im Vergleich zu den nicht infizierten Inserts signifikant an.
Die konsistente Durchführung von TEER-Messungen ist entscheidend, um mit dieser Methode reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Die Einhaltung strenger steriler Techniken, um eine Kontamination zu vermeiden, ist ebenfalls sehr wichtig.
