Questo metodo consente di confrontare le capacità di transcitosi di vari ceppi equalizzati attraverso cellule epiteliali intestinali polarizzate con giunzioni mature. Questa è una tecnica relativamente semplice che non richiede un ampio uso di risorse o tempo e consente di indagare un passo importante nella patogenesi della malattia invasiva neonatale di E.coli. A dimostrare la procedura sarà Josh Wheatley, un assistente di ricerca nel mio laboratorio.
Lavorando all'interno di un armadio di biosicurezza, seminare cellule T84 in colture cellulari di membrana in polietilene tereftalato che Transwell inserisce. In una piastra da 24 pozzetti progettata per contenere inserti Transwell, riempire il numero desiderato di pozzetti di raccolta con un millilitro di terreno di coltura tissutale o MTC con antibiotici. Seminare questi inserti con una volta 10 alla quinta cellule T84 sospese in 500 microlitri di MTC con antibiotici.
Circa 48 ore dopo la semina, verificare con microscopia ottica se i monostrati hanno iniziato a diventare confluenti. Ogni due giorni dopo la semina, misurare e registrare la resistenza elettrica transepiteliale o TEER utilizzando un volt epiteliale per OM meter o EVOM. Prima di misurare il TEER, decontaminare la sonda elettrica immergendola in cinque millilitri di etanolo al 70% per 10-15 minuti.
Rimuovere la sonda, scrollarsi di dosso l'etanolo in eccesso e lasciarlo asciugare all'aria all'interno dell'armadio di biosicurezza per 10 minuti. Testare l'EVOM e sondare posizionando la sonda decontaminata a secco in un pozzetto sterile contenente un millilitro di MTC con antibiotici con un inserto sterile all'interno contenente 500 microlitri di MTC con antibiotici. Assicurarsi che la lettura EVOM sia inferiore a 200 OM. Registrare questo valore vuoto per utilizzarlo nei calcoli successivi della resistenza.
Rimuovere la sonda dal tubo di MTC con antibiotici. Abbassare delicatamente la sonda nel primo inserto con l'elettrodo lungo nel pozzetto di raccolta. Lasciare che l'elettrodo tocchi il fondo del pozzo di raccolta, ma non spingere verso il basso in quanto ciò potrebbe disturbare il monostrato epiteliale e l'elettrodo corto all'interno dell'inserto.
Al termine, decontaminare la sonda nell'etanolo. Sottrarre il valore di resistenza del bianco da ciascun valore ottenuto da ciascun inserto contenente celle T84. Quindi moltiplicare la resistenza risultante per ciascun inserto per l'area del fondo di ciascun inserto per ottenere la misurazione finale TEER.
Una volta che il TEER raggiunge 1000 OMs per centimetro quadrato, il monostrato epiteliale è maturo e pronto per i test di infezione. Man mano che il TEER matura, fornire alle cellule un terreno fresco ogni uno o due giorni. In una nuova piastra da 24 pozzetti, aggiungere un millilitro di MTC con antibiotici a un pozzetto per ogni inserto seminato.
Usando una pinza sterile, trasferire con attenzione gli inserti nei pozzetti appena riforniti. Sostituire il supporto negli inserti. Rimuovere i vecchi supporti dagli inserti inclinando la piastra e rimuovere delicatamente il supporto con una punta di pipetta lungo il lato dell'inserto.
Aggiungere 500 microlitri di MTC con antibiotici agli inserti e visualizzare il monostrato per verificare che rimanga intatto. Il giorno prima dell'esperimento, misurare e registrare il TEER. Sostituire il mezzo con un millilitro di MTC senza antibiotici nel pozzetto della piastra e 500 microlitri nell'inserto.
Prendi un tubo conico da 15 millilitri etichettato con cinque millilitri di brodo lisogenico sterile o LB e usa un lubrificante sterile per inoculare il brodo con una colonia da un ceppo di Escherichia coli. Incubare la coltura durante la notte con il tappo dal tubo allentato. Il giorno successivo, aggiungere 250 microlitri da coltura LB durante la notte a 25 millilitri di MTC senza antibiotici in un tubo conico da 50 millilitri.
Incubare il tubo per due ore. Misurare il TEER su ciascun inserto. Registrarli come TEER al momento T fino all'ora zero.
Spostare gli inserti nei pozzetti in una nuova piastra e cambiare il supporto. Riempire i nuovi pozzetti di raccolta con 500 microlitri e inserti con 400 microlitri di MTC senza antibiotici per le mani. Conservare gli inserti all'interno dell'incubatore di coltura tissutale fino al momento dell'infezione.
Dopo due ore, rimuovere le colture batteriche mattutine dallo shaker e centrifugare. Risospendere il pellet in MTC senza antibiotici. Quindi utilizzare uno spettrofotometro per regolare la densità ottica o OD a 0,7 o 0,9 e diluire ulteriormente a una concentrazione di 1 milione di unità formanti colonie o CFU per millilitro.
Infettare ogni inserto con 100 microlitri di inoculo regolato OD. Annotare l'ora e registrarla come ora zero. Posizionare la sospensione batterica dell'inoculo alla quantità di CFU per millilitro utilizzando il metodo di diluizione del binario placcando 10 microlitri di aliquota su una piastra quadrata LB a coclea.
Ogni 30 minuti dopo l'inoculazione, riempire nuovi pozzetti con 500 microlitri di MTC senza antibiotici e trasferire gli inserti in questi nuovi pozzetti. Raccogliere il supporto dal pozzo di raccolta utilizzato per ogni inserto in un tubo etichettato separato e posizionare il tubo sul ghiaccio. Riportare la piastra Transwell nell'incubatore tra i punti temporali.
Per ogni inserto, combinare brevemente i supporti raccolti da diversi punti temporali e vortici. Placcare i mezzi raccolti su piastre a coclea LB utilizzando il metodo di diluizione della traccia per quantificare il numero di batteri transcitosi nelle prime due ore dell'esperimento. Raccogli i media a quattro e sei ore.
Inoltre, a sei ore, placcare il fluido dai pozzetti di controllo. A sei ore, misurare e registrare il TEER. Dopo l'incubazione notturna, contare manualmente le colonie batteriche sulle piastre LB di diluizione della pista.
Durante la proliferazione delle cellule sterili T84, i TEER attraverso i monostrati T84 aumentano continuamente nel tempo, superando i 1000 OM per centimetro quadrato approssimativamente dopo sette giorni dalla semina. La transcitosi degli isolati neonatali di E.coli nel tempo è mostrata qui. I confronti dei valori medi di transcitosi hanno dimostrato differenze significative tra gli isolati neonatali di E.coli uno rispetto a due ore dopo l'infezione.
Al contrario, il ceppo non patogeno di E.coli DH5 alfa ha subito una transcitosi minima. I risultati di TEER prima e dopo l'infezione con due isolati clinici neonatali di E.coli con diverse capacità di transcitosi delle cellule epiteliali intestinali sono mostrati qui. La velocità e la quantità di transcitosi variano tra i ceppi, ma il TEER aumenta significativamente dopo l'infezione con entrambi i ceppi patogeni rispetto agli inserti non infetti.
Eseguire misurazioni TEER in modo coerente è fondamentale per ottenere risultati riproducibili con questo metodo. Anche seguire rigorose tecniche sterili per evitare la contaminazione è molto importante.
