שיטה זו מאפשרת להשוות את יכולות הטרנסציטוזה של זנים שווים שונים על פני תאי אפיתל מעיים מקוטבים עם צמתים בוגרים. זוהי טכניקה קלה יחסית שאינה דורשת שימוש נרחב במשאבים או בזמן, ומאפשרת לחקור צעד חשוב בפתוגנזה של מחלה פולשנית E.coli ילודים. מי שידגים את ההליך יהיה ג'וש ויטלי, עוזר מחקר במעבדה שלי.
עבודה בתוך ארון בטיחות ביולוגית, זרע תאי T84 לתוך פוליאתילן טרפתלט תרבית תא ממברנה Transwell מכניסה. בצלחת 24 בארות שנועדה להחזיק תוספות טרנסוול, מלאו את המספר הרצוי של בארות איסוף במיליליטר אחד של תרבית רקמה בינונית או TCM באנטיביוטיקה. זרעו את התוספות האלה עם 10 פעמים עד תאי T84 חמישיים המרחפים ב-500 מיקרוליטרים של TCM עם אנטיביוטיקה.
כ-48 שעות לאחר הזריעה, יש לוודא במיקרוסקופיה קלה אם המונו-שכבות החלו להתמזג. כל יומיים לאחר הזריעה, מדוד ורשום את ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתליאלית או TEER באמצעות וולט אפיתל לכל מד OM או EVOM. לפני מדידת ה- TEER, נטרל את הבדיקה החשמלית על ידי טבילתה בחמישה מיליליטר של 70% אתנול למשך 10 עד 15 דקות.
הסר את הבדיקה, לנער את עודפי האתנול, ולתת לו להתייבש באוויר בתוך ארון biosafety במשך 10 דקות. בדוק את ה- EVOM והבדיקה על ידי הצבת הבדיקה היבשה המפורקת בבאר סטרילית המכילה מיליליטר אחד של TCM עם אנטיביוטיקה עם תוספת סטרילית בפנים המכילה 500 מיקרוליטר של TCM עם אנטיביוטיקה. ודא שקריאת EVOM היא פחות מ- 200 OM. רשום ערך ריק זה כדי להשתמש בו בחישובי ההתנגדות המאוחרים יותר.
הסר את הבדיקה מן הצינור של TCM עם אנטיביוטיקה. מנמיכים בעדינות את הבדיקה לתוך התוספת הראשונה עם האלקטרודה הארוכה בבאר האיסוף. אפשרו לאלקטרודה לגעת היטב בתחתית האיסוף, אך אל תדחפו כלפי מטה מכיוון שהדבר עלול לשבש את המונו-שכבה האפיתליאלית ואת האלקטרודה הקצרה בתוך התוספת.
בסיום, לפרק את הבדיקה באתנול. הפחת את ערך ההתנגדות הריק מכל ערך המתקבל מכל הוספה המכילה תאי T84. לאחר מכן הכפל את ההתנגדות המתקבלת עבור כל הוספה באזור החלק התחתון של כל הוספה כדי לקבל את מדידת ה- TEER הסופית.
ברגע שה- TEER מגיע ל- 1000 OMs לסנטימטר מרובע, המונולייר האפיתל בוגר ומוכן למבחני זיהום. כאשר ה- TEER מתבגר, ספק לתאים מדיום טרי כל יום עד יומיים. בצלחת חדשה של 24 בארות, הוסיפו מיליליטר אחד של TCM עם אנטיביוטיקה לבאר אחת עבור כל תוסף שנזרע.
באמצעות מלקחיים סטריליים, בזהירות להעביר את התוספות לבארות שהתחדשו לאחרונה. החלף את המדיה בתוספות. הסר את המדיה הישנה מהתוספות על ידי הטיית הלוח, והסר בעדינות את המדיה עם קצה פיפטה לאורך צד התוספת.
הוסף 500 microliters של TCM עם אנטיביוטיקה לתוספות ולדמיין את monolayer כדי לוודא שהוא נשאר שלם. יום לפני הניסוי, מדדו ותעדו את ה-TEER. החלף את המדיום עם מיליליטר אחד של TCM ללא אנטיביוטיקה בצלחת היטב, ו 500 microliters להוסיף.
קח צינור חרוטי מסומן 15 מיליליטר עם חמישה מיליליטר של מרק ליזוגני סטרילי או LB, והשתמש סיכה סטרילית כדי לחסן את המרק עם מושבה אחת מזן Escherichia coli אחד. דגרו את התרבות למשך הלילה כשהכובע מהצינור משוחרר. למחרת, הוסף 250 מיקרוליטר מתרבית LB לילה ל -25 מיליליטר של TCM ללא אנטיביוטיקה בצינור חרוטי של 50 מיליליטר.
לדגור את הצינור במשך שעתיים. מדוד את ה- TEER בכל הוספה. רשום אותם כ- TEERs בזמן T עד שעת אפס.
העבר את התוספות לבארות בלוח חדש ושנה את המדיה. מלאו את בארות האיסוף החדשות ב-500 מיקרוליטרים ותוספות ב-400 מיקרוליטרים של TCM ללא אנטיביוטיקה ידנית. שמור את התוספות בתוך אינקובטור תרבית רקמה עד לזמן ההדבקה.
לאחר שעתיים, הסר את תרביות החיידקים של הבוקר מהשייקר והצנטריפוגה. יש להשעות את הכדור ב-TCM ללא אנטיביוטיקה. לאחר מכן השתמש בספקטרופוטומטר כדי להתאים את הצפיפות האופטית או OD ל-0.7 או 0.9 ולדלל עוד יותר לריכוז של מיליון יחידות יוצרות מושבה או CFU למיליליטר.
להדביק כל תוספת עם 100 microliters של inoculum מותאם OD. שים לב לשעה ורשום אותה כשעת אפס זמן. מקם את תרחיף חיידקי האינוקולום לכמות CFU למיליליטר באמצעות שיטת דילול המסילה וציפוי 10 מיקרוליטר אליקוט על צלחת אוגר LB מרובעת.
כל 30 דקות לאחר החיסון, מלאו בארות חדשות ב-500 מיקרוליטרים של TCM ללא אנטיביוטיקה, והעבירו את התוספות לבארות החדשות הללו. אספו את המדיה מבאר האיסוף המשומשת עבור כל תוסף לצינור מסומן נפרד והניחו את הצינור על קרח. החזירו את צלחת טרנסוול לחממה בין נקודות זמן.
עבור כל הוספה, שלב את המדיה שנאספה מנקודות זמן שונות ומערבולת בקצרה. צלחת את המדיה שנאספה על לוחות אוגר LB באמצעות שיטת דילול המסלול כדי לכמת את מספר החיידקים טרנסציטוז בשעתיים הראשונות של הניסוי. אסוף את המדיה בארבע ושש שעות.
בנוסף, בשש שעות, צלחת את המדיה מבארות הבקרה. בשש שעות, מדוד והקלט את ה- TEER. לאחר דגירה של לילה, ספרו את מושבות החיידקים באופן ידני על לוחות LB של דילול המסלול.
במהלך התפשטות תאי T84 הסטריליים, ה- TEERs על פני המונוליירים של T84 עולים ברציפות לאורך זמן, ועולים על 1000 OMs לסנטימטר מרובע בערך לאחר שבעה ימים מהזריעה. טרנסציטוזה של E.coli ילודים מבודדים לאורך זמן מוצגת כאן. ההשוואות של ערכי הטרנסציטוזה הממוצעים הראו הבדלים משמעותיים בין E.coli בילוד אחד לעומת שניים בשעתיים לאחר ההדבקה.
לעומת זאת, זן E.coli הלא-פתוגני DH5 אלפא עבר טרנסציטוזה מינימלית. תוצאות TEER לפני ואחרי הדבקה בשני מבודדים קליניים של E.coli עם יכולות שונות לתאי אפיתל מעיים טרנסציטוז מוצגים כאן. הקצב והכמות של טרנסציטוזה משתנים בין זנים אך ה- TEER עולה באופן משמעותי לאחר זיהום בשני הזנים הפתוגניים בהשוואה לתוספות שאינן נגועות.
ביצוע מדידות TEER באופן עקבי הוא חיוני להשגת תוצאות הניתנות לשחזור בשיטה זו. בעקבות טכניקות סטריליות קפדניות כדי למנוע זיהום הוא גם מאוד חשוב.
