يسمح هذا البروتوكول بالعزل السلس، والاستزراع، والاستجواب للاستجابات النسخية في نسب خلايا محددة من C.elegans. والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي مستوى عال من القدرة على التكيف مع مراحل الحياة المختلفة للدودة أو أنواع محددة من الخلايا التي سيتم عزلها. سأبرهن على العملية أنا وناتالية زاهايكو، وهي فنيّة من مختبرنا.
بعد جمع الحيوانات، الطرد المركزي لهم في 1600 مرات ز لمدة خمس دقائق. إزالة كل من افرا و resuspend الديدان في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام M9. نقل التعليق إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر.
أجهزة الطرد المركزي في 1600 مرة ز لمدة خمس دقائق ل بيليه الديدان. ثم إضافة 200 ميكرولترات من المخزن المؤقت SDS-DTT واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. يجب أن تظهر الديدان الآن أن تكون مجعدة على طول الجسم إذا كان ينظر إليها تحت المجهر الخفيف.
بعد ذلك ، أضف 800 ميكرولترات من عازلة العزلة الباردة الجليدية واخلطها عن طريق النقر بلطف على الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي في 13،000 مرات ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة ل بيليه الديدان. إزالة افرات وغسل مع ملليلتر واحد من العازلة العزل.
كرر عملية الطرد المركزي وغسل ما مجموعه خمس مرات، مع التأكد من إزالة المخزن المؤقت في كل مرة. بعد هذا، إضافة 100 ميكرولترس من خليط البروتياز من ستربتومايس غريسوس، حل في عازلة العزلة، إلى بيليه. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة، مع التأكد من تطبيق تعطيل الميكانيكية عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 60 إلى 70 مرة مع طرف ميكروبيبيت 200 ميكرولتر ضد الجزء السفلي من الأنبوب.
لتحديد مرحلة الهضم، إزالة واحد إلى خمسة ميكرولترات من خليط الهضم، وإسقاطه على شريحة زجاجية، وتفتيشه باستخدام مجهر زراعة الأنسجة. بعد خمس إلى سبع دقائق، يجب أن يكون لشظايا الدودة بشرة مخفضة بشكل واضح وسيكون الطين من الخلايا مرئيًا بسهولة. وقف رد الفعل بإضافة 900 ميكرولترات من Leibovitz المتاحة تجاريا L-15 المتوسطة، وتستكمل مع 10٪ FBS والبنسلين شتربتوميسين.
أجهزة الطرد المركزي في 10،000 مرة ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق ل بيليه الشظايا المعزولة والخلايا. غسل الخلايا بيليه مرتين أكثر مع وسائل الإعلام L-15 الباردة المكملة باستخدام ملليلتر واحد من وسائل الإعلام في غسل. resuspend الخلايا بيليه في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام L-15 تكمل, وتترك على الجليد لمدة 30 دقيقة.
ثم تأخذ الطبقة العليا، والتي هي ما يقرب من 700 إلى 800 ميكرولتر، ونقلها إلى أنبوب microcentrifuge. استخدام عداد الخلايا الآلي أو قياس كثافة الخلية من 10 إلى 25 ميكرولترات من الخلايا المعزولة. خلايا الطرد المركزي من تعليق الخلية المعزولة في 10،000 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
تخلص من الخلايا الفائقة و resuspend في L-15 تكمل المتوسطة إلى كثافة الخلية التي لا تزيد عن ستة ملايين خلية لكل ملليلتر لتجنب الحمولة الزائدة على جهاز قياس التدفق. ثم، فرز الخلايا حسب تعبير إيجابي GFP باستخدام مقياس تدفق الخلايا قادرة على فرز العينات. يمكن استخدام الخلايا السلبية GFP كتحكم في التحليل غير النوع الخلية.
بعد ذلك، قم بطبق الخلايا المعزولة في آبار صفيحة ستة آبار معقمة، ضع اللوحة في وعاء بلاستيكي، أضف مسح رطب أو ورق من الأنسجة الرخوة لإضافة الرطوبة إلى الخلايا، واحتضان في 20 درجة مئوية. خلايا الطرد المركزي من تعليق الخلية المعزولة في أنبوب RNase 1.5 ملليلتر خالية من microcentuge في 10،000 مرة ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. باستخدام micropipette، وإزالة عظمى وإضافة 100 ميكرولترات من M9 المتوسطة لغسل بعيدا المتوسطة L-15 المكملة.
بعد ذلك، الطرد المركزي الخلايا في 10،000 مرات ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق وإزالة فائقة. كرر عملية الغسل والطرد المركزي ثلاث مرات المجموع لضمان إزالة جميع وسائل الإعلام، مع التأكد من إزالة بعناية عظمى في كل مرة. ثم، إضافة ملليلتر واحد من الفينول وguanidine حل متساوي التمامية للخلايا والماصات تعليق صعودا وهبوطا بعناية.
احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، إضافة 250 ميكرولترات من الكلوروفورم وعكس بلطف الأنبوب 15 إلى 20 مرة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
أجهزة الطرد المركزي في 10،000 مرة ز و 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. استخدام micropipette لإزالة بعناية أكبر قدر من الطبقة مائي أعلى ممكن، مع التأكد من عدم إزعاج الطبقات العضوية السفلية. نقل الطبقة السفلية إلى جديد 1.5 ملليلتر RNase خالية من microcentrifuge أنبوب.
إلى أنبوب جديد، إضافة 500 ميكرولترات من الايزوبروبانول ومزيج عن طريق عكس الأنبوب. احتضان هذا الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم الطرد المركزي الأنبوب في 14، 000 مرات ز و 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
ضع العينات على الجليد واستخدم ميكروسيبيت لإزالة أكبر قدر ممكن من الأيزوبروبانول. أضف برفق ملليلتر واحد من 70٪ من الإيثانول في الماء المقطر المزدوج الخالي من RNase إلى الأنبوب عن طريق تطبيقه على جانب الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 مرة ز و 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
إزالة معظم الإيثانول والسماح للأنبوب الهواء الجاف على الجليد لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. بعد ذلك، أضف 15 إلى 20 ميكرولترات من المياه المقطرة المزدوجة الخالية من RNase. استخدم مقياس طيفي في 260 نانومتر لقياس تركيز الحمض النووي الريبي ونقاوته.
في هذه الدراسة، unc-17:GFP إيجابية cholinergic الخلايا العصبية يتم استخراجها وعزلها من الدودة المستديرة C.elegans لدراسات لاحقة السابقين فيفو. يتم التعبير عن الجين unc-17 في جميع أنحاء الجسم C.elegans، ورموز لنقل أستيل عبر الميكبران في الوريد. التعبير عن هذا الجين يمكن ملاحظته في الرأس، والخلايا العصبية في الجسم المتوسط، والذيل، وإسقاطات الخلايا العصبية.
تظهر هنا صور ميكروجرافية مُنمَرة من unc-17: الخلايا العصبية الإيجابية بعد العزلة، بالإضافة إلى التحكم السلبي في الحيوانات غير المعدلة من نوع N2. يمكن أن تبقى الخلايا المعزولة على قيد الحياة لمدة تصل إلى ثلاثة أيام عندما تستكمل مع L-15 L-15 متوسطة و 10٪ FBS. تظهر هنا بيانات تمثيلية لـ qPCR من الخلايا العصبية الكوللينية المعبرة عن GFP ، بالإضافة إلى خلايا العضلات المعبرة عن GFP.
بعد فرز الخلايا بنجاح، يتم عزل RNA عن طريق طريقة الفينول وguanidine isothiocyanate، وبعد ذلك تم إنتاج cDNA باستخدام مجموعة توليفية. التعبير عن الجينات الكولينيرية الخاصة بالخلايا العصبية، TPH-1، هيدروكسيلاس التربتوفان، وsnb-1، وهو ناقل الحوية متشابك، مرتفعة في unc-17:GFP الخلايا المعزولة. ومع ذلك، هذا التعبير غير موجود في خلايا معزولة ميو-3:GFP.
المعكوس صحيح مع التعبير عن نسخة سلسلة الميوسين الثقيلة للعضلات من ميو-2 ، حيث يقتصر التعبير عن هذا الجين على خلايا العضلات المعزولة ، ولكن ليس الخلايا الكولينية المعزولة. من المهم احتضان الديدان بالكامل. ومع ذلك، يمكن أن يؤدي حضانة الموسعة من بشرة الدودة في موت دودة أو إجهاد إضافي للحيوان.
بعد العزل، يمكن أن تكون الخلايا إما مثقف لفترة من الزمن، أو استخدامها لعزل RNA وتحليل qRT-PCR. يمكن تحليل الخلايا العصبية المستزرعة عن طريق قياسات الالكتروفوريس المشبك التصحيح. قد تسهل هذه التقنية تحليل الخلايا الحية السابقة لمجموعات محددة من الخلايا، مما يساعد على تحسين فهمنا للاستجابات الخاصة بالخلايا في سياق الكائنات متعددة الخلايا في مراحل مختلفة من دورة حياتها.
وبما أن المواد الكيميائية مثل SDS وDTT تستخدم أثناء هذه التجربة، ينبغي اتباع إجراءات السلامة المختبرية العامة أثناء صنع واستخدام المخازن المؤقتة.
