هذا البروتوكول مهم لأنه يصف أداة مهمة أخرى لتشريح البيولوجيا الجزيئية لعامل مرض لايم Borrelia burgdorferi. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه باستخدام نقل العاثيات ، فإنه يوفر طريقة بديلة لإدخال الحمض النووي في Borrelia burgdorferi دون الحاجة إلى تطبيق نبضة كهربائية ، كما هو الحال في التثقيب الكهربائي. يمكن استخدام هذه الطريقة لتوفير مزيد من التبصر في الآليات الجزيئية التي يستخدمها Borrelia burgdorferi للاستمرار في دورته الحيوانية والتسبب في نهاية المطاف مرض لايم في البشر.
للبدء ، قم بتلقيح 150 ميكرولتر من استنساخ Borrelia burgdorferi المناسب إلى 15 ملليلتر من BSK في أنابيب طرد مركزي مخروطية معقمة بإحكام لبروتوكول النقل. بعد ذلك ، استكمل الوسط بالتركيز المناسب للمضادات الحيوية أو مجموعة من المضادات الحيوية لاختيار وصيانة الحمض النووي غير المتجانس داخل استنساخ Borrelia burgdorferi واحتضان العينة عند 33 درجة مئوية. بعد أن نمت الثقافة ، قم بالطرد المركزي الحجم المناسب للثقافة عند 6،000 غرام لمدة 10 دقائق.
بعد صب المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في أربعة ملليلتر في BSK الطازج وانقل العينة إلى أصغر أنبوب معقم متاح لحمل العينة بأقل مساحة للرأس. بعد ذلك ، أضف الكمية المناسبة من العامل المحرض إلى التركيز الموصى به بناء على حجم مزرعة يبلغ أربعة ملليلتر للحث على إنتاج العاثيات ، وقم بتغطية الأنبوب بإحكام ، واخلطه جيدا. احتضان العينة عند 33 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى أربع ساعات.
ثم انقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. الطرد المركزي العينة في 6،000 غرام لمدة 10 دقائق. بعد صب المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 15 ملليلتر من BSK.
استكمل الثقافة المحضرة بتركيز المضادات الحيوية المناسب الموصوف في المخطوطة ، مع احتضان العينة عند 33 درجة مئوية لمدة 72 إلى 96 ساعة. لتحضير محاليل لترسيب PEG ، قم بإعداد 500 ملليلتر من كلوريد الصوديوم الخماسي المولي ، و 500 ملليلتر من 40٪ PEG ، و 100 ملليلتر من وسط التعليق كما هو موضح في المخطوطة. للتعقيم ، الأوتوكلاف الحل ، تبرد قبل الاستخدام ، وتخزين درجة حرارة الغرفة أو أربع درجات مئوية.
بالنسبة لهطول الأمطار PEG من العاثية من استنساخ Borrelia burgdorferi المانح ، بعد 72 إلى 96 ساعة من الحضانة ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 8،000 G لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. صب المادة الطافية في أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 ملليلتر وتخلص من حبيبات الخلية. أضف كلوريد الصوديوم خماسي المولي إلى التركيز النهائي لمولار واحد.
بعد الخلط جيدا ، صخر برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. أجهزة الطرد المركزي العينات في 8،000 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد صب المادة الطافية في أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 ملليلتر كما هو موضح سابقا ، أضف محلول 40٪ PEG-8000 إلى المادة الطافية إلى تركيز نهائي بنسبة 10٪ اخلطي جيدا وضعيه على الثلج لأكثر من ساعة ، حتى طوال الليل.
جهاز طرد مركزي للعينات عند 8،000 G لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية كما هو موضح سابقا. تخلص من المادة الطافية وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل الزائدة دون فقد أي حبيبات تحتوي على جزيئات العاثية. أعد تعليق الحبيبات في الحد الأدنى من حجم وسط التعليق باستخدام وسيط التعليق لغسل جانب الزجاجة وجمع أي جزيئات عاثية محتملة.
عالج عينة العاثية المستردة بحجم متساو من الكلوروفورم بناء على حجم التعليق. امزج العينة جيدا وأجهزة الطرد المركزي عند 8،000 جم لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة الطبقة المائية إلى أنبوب نظيف ، وتجنب أي من طبقات الواجهة السميكة.
بعد تحديد الحجم المسترد ، بعد المعالجة الأولى بالكلوروفورم ، قم مرة أخرى بمعالجة العينة بكمية من الكلوروفورم تساوي 10٪ من هذا الحجم. انقل الطبقة المائية إلى أنبوب نظيف مع الحرص على تجنب أي من الواجهة أو الطبقات العضوية. استخدم العاثية على الفور أو قم بتخزينها عند أربع درجات مئوية.
بعد تحضير مزارع Borrelia burgdorferi لاستخدامها كمتلقي في فحوصات النقل كما هو موضح سابقا ، قم بالطرد المركزي بحجم الثقافة عند 6،000 G لمدة 10 دقائق. صب المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 14.5 ملليلتر من BSK الطازج. أضف أقل من أو يساوي 500 ميكرولتر من عينة العاثية المترسبة ب PEG إلى ثقافة استنساخ المتلقي.
بعد الخلط جيدا ، احتضن عند 33 درجة مئوية لمدة 72 إلى 96 ساعة. قم بإجراء اختيار المحولات عن طريق الطلاء في الطور الصلب بعد الخلط مع العاثية المترسبة ب PEG كما هو موضح في المخطوطة. اعتمادا على خلفية استنساخ المستلم ، تحقق من ظهور المستعمرات داخل الأغاروز على لوحات الاختيار بعد 10 إلى 21 يوما من الحضانة.
اختر ما لا يقل عن 5 إلى 10 مستعمرات تنمو على الطبق في وجود كلا المضادات الحيوية باستخدام ماصة البورسليكات المعقمة 5.75 بوصة الموصولة بالقطن وقم بتلقيحها في 1.5 ملليلتر من BSK بالمضادات الحيوية المناسبة. تم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للجينات على 10 من الحيوانات المستنسخة التي تشفر مقاومة الكانامايسين والجنتاميسين. يمكن تضخيم جين مقاومة الكانامايسين من المتبرع c1673 والتحويلات المحتملة ولكن ليس المتلقي c1706.
وبالمثل ، يمكن تضخيم جين مقاومة الجنتامايسين من المتلقي c1706 والتحويلات المحتملة ولكن ليس المتبرع ، مما يمثل أحداث النقل. لإثبات أن كاسيت مقاومة الكانامايسين قد تم تحويله بواسطة 5BB1 من المتبرع إلى المتلقي. تم تحديد خلفية المحولات باستخدام علامات خاصة بالإجهاد.
يقوم استنساخ c1673 وخلفية CA-112A بتشفير مضخمات محددة أربعة وخمسة وستة ، في حين أن c1706 ، الذي يحتوي على خلفية B31 عالية المرور ، لا يفعل ذلك. وبالمثل ، كان المحولات واحد واثنان يفتقدان إلى الأمبليكون أربعة وخمسة وستة ، مما يدل على أن الحيوانات المستنسخة لها خلفية c1706 واكتسبت جين مقاومة الكانامايسين من c1673. بالنسبة لترسيب PEG للعاثية ، قم بتنفيذ جميع الخطوات بعناية لزيادة إنتاجية العاثية إلى أقصى حد ومعالجة العاثية المعاد تعليقها تماما باستخدام الكلوروفورم لإزالة أكبر قدر ممكن من ملوثات PEG ووسائط الاستزراع قبل استخدام العاثية وتخزينها.
بمجرد إجراء اختبار النقل بنجاح والتحقق من المحول ، تكون هذه الحيوانات المستنسخة متاحة للإجابة على الأسئلة التي تتطلب Borrelia burgdorferi المعدلة وراثيا. نأمل أن يسمح تطوير هذه التقنية للباحثين بالتلاعب وراثيا بسلالات Borrelia burgdorferi التي يصعب حاليا إدخال الحمض النووي عن طريق التثقيب الكهربائي.
