פרוטוקול זה משמעותי משום שהוא מתאר כלי חשוב נוסף לניתוח הביולוגיה המולקולרית של סוכן מחלת ליים Borrelia burgdorferi. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי באמצעות התמרת פאגים, היא מספקת שיטה חלופית להחדרת DNA ב Borrelia burgdorferi ללא צורך ביישום של פולס חשמלי, כמו אלקטרופורציה. שיטה זו יכולה לשמש כדי לספק תובנה נוספת על המנגנונים המולקולריים המשמשים את Borrelia burgdorferi כדי להתמיד במחזור האנזוטי שלה ובסופו של דבר לגרום למחלת ליים בבני אדם.
כדי להתחיל, לחסן 150 מיקרוליטרים של שיבוט Borrelia burgdorferi המתאים לתוך 15 מיליליטר של BSK בצינורות צנטריפוגה חרוטית סטרילית סגורה היטב עבור פרוטוקול הטרנסדוקציה. לאחר מכן, השלימו את המדיום עם הריכוז המתאים של אנטיביוטיקה או שילוב של אנטיביוטיקה לבחירה ותחזוקה של דנ"א הטרולוגי בתוך שיבוט Borrelia burgdorferi ודגירה של הדגימה ב 33 מעלות צלזיוס. לאחר שהתרבות גדלה, צנטריפוגה את נפח התרבות המתאים ב 6, 000 G במשך 10 דקות.
לאחר פירוק הסופרנטנט, יש להשעות את הכדור בארבעה מיליליטר ב-BSK טרי ולהעביר את הדגימה לצינור הסטרילי הקטן ביותר שקיים כדי להחזיק את הדגימה עם שטח ראש מינימלי. לאחר מכן, הוסיפו את הכמות המתאימה של חומר משרה לריכוז המומלץ בהתבסס על נפח תרבית של ארבעה מיליליטר כדי לגרום לייצור פאגים, כסו את הצינור בחוזקה וערבבו היטב. לדגום את הדגימה ב 33 מעלות צלזיוס במשך שעתיים עד ארבע שעות.
לאחר מכן, העבר את הדגימה לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. צנטריפוגה המדגם ב 6, 000 G במשך 10 דקות. לאחר decanting supernatant, להשעות את כדור התא ב 15 מיליליטר של BSK.
השלימו את התרבית המוכנה עם ריכוז האנטיביוטיקה המתאים המתואר בכתב היד, תוך דגירה של הדגימה בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס למשך 72 עד 96 שעות. כדי להכין פתרונות למשקעי PEG, הכינו 500 מיליליטר של נתרן כלורי בעל חמישה טוחנות, 500 מיליליטר של 40% PEG, ו-100 מיליליטר של מדיום השעיה כמתואר בכתב היד. כדי לעקר, יש לקרר את התמיסה באופן אוטומטי, לקרר לפני השימוש ולאחסן את טמפרטורת החדר או ארבע מעלות צלזיוס.
עבור משקעי PEG של פאג מהתורם Borrelia burgdorferi שיבוט, לאחר 72 עד 96 שעות של דגירה, צנטריפוגה את הדגימות ב 8, 000 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מפרקים את הסופר-נאטנט לתוך צינור חרוטי נקי של 50 מיליליטר ומשליכים את כדור התא. הוסיפו נתרן כלורי בעל חמש טוחנות לריכוז סופי של טוחנת אחת.
לאחר ערבוב טוב, רוק בעדינות בטמפרטורת החדר במשך שעה. צנטריפוגה דגימות ב 8, 000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר פירוק הסופרנאטנט לתוך צינור חרוטי נקי של 50 מיליליטר כפי שהוכח קודם לכן, הוסיפו תמיסת 40%PEG-8000 לסופרנטנט לריכוז סופי של 10% ערבבו היטב והניחו על הקרח למשך יותר משעה, עד ללילה.
צנטריפוגה לדגימות ב 8, 000 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס כפי שהוכח קודם לכן. השליכו את הסופר-נטנט והסירו כמה שיותר נוזלים עודפים מבלי לאבד כדור, המכיל את חלקיקי הפאגים. יש לתלות את הכדור בנפח מינימלי של מדיום התרחיף באמצעות מדיום התרחיף כדי לשטוף את דופן הבקבוק ולאסוף חלקיקי פאגים פוטנציאליים.
טפלו בדגימת הפאגים המשוחזרת בנפח שווה של כלורופורם בהתבסס על נפח ההדחה. מערבבים היטב את הדגימה צנטריפוגה ב 8, 000 G במשך 10 דקות. לאחר מכן, הסר את השכבה המימית לצינור נקי, תוך הימנעות מכל שכבות הממשק העבות.
לאחר קביעת הנפח שהתאושש, לאחר הטיפול הראשון בכלורופורם, שוב לטפל בדגימה עם כמות של כלורופורם שווה ל 10% מנפח זה. העבירו את השכבה המימית לצינור נקי תוך הקפדה על הימנעות מהממשק או מהשכבות האורגניות. השתמש בפאג מיד או אחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הכנת תרבויות Borrelia burgdorferi שישמשו כמקבל במבחני התמרה כפי שהוכח קודם לכן, צנטריפוגה את נפח התרבות ב 6, 000 G במשך 10 דקות. דקנט את הסופר-נטנט והושיע את הכדור ב-14.5 מיליליטר של BSK טרי. הוסף פחות או שווה ל-500 מיקרוליטרים של דגימת פאג'ים משופעת PEG לתרבית השיבוט של המקבל.
לאחר ערבוב טוב, לדגור ב 33 מעלות צלזיוס במשך 72 עד 96 שעות. בצע את בחירת המתמרים על ידי ציפוי פאזה מוצקה לאחר ערבוב עם פאג מזורז PEG כמתואר בכתב היד. בהתאם לרקע של השיבוט של הנמען, בדוק כי המושבות מופיעות בתוך agarose על לוחות הבחירה לאחר 10 עד 21 ימים של דגירה.
בחרו לפחות 5 עד 10 מושבות שגדלות על הצלחת בנוכחות שתי האנטיביוטיקות באמצעות פיפטה בורוסיליקט 5.75 אינץ' מכותנה מעוקרת ולחסן אותן ל-1.5 מיליליטר של BSK עם האנטיביוטיקה המתאימה. הגברת ה-PCR של הגנים בוצעה ב-10 מהשיבוטים המקודדים עמידות לקנאמיצין וגנטמיצין. ניתן להגביר את גן העמידות לקנאמיצין מהתורם c1673 ומהטרנסדוקטים הפוטנציאליים, אך לא מהמקבל c1706.
באופן דומה, ניתן להגביר את גן העמידות לגנטמיצין מהמקבל c1706 ומהמתמרים הפוטנציאליים אך לא מהתורם, המייצגים אירועי טרנסדוקציה. כדי להדגים כי קלטת ההתנגדות לקנאמיצין הותמרה על ידי 5BB1 מהתורם למקבל. הרקע של המתמרים נקבע באמצעות סמנים ספציפיים לזן.
השיבוט c1673 והרקע CA-112A מקודדים אמפליקונים ספציפיים ארבע, חמש ושש, ואילו c1706, בעל רקע B31 בעל מעבר גבוה, לא. באופן דומה, המתמרים 1 ו-2 היו חסרים אמפליקונים ארבע, חמש ושש, מה שמוכיח כי לשיבוטים יש את הרקע c1706 ורכשו את גן העמידות לקנאמיצין מ-c1673. עבור משקעי PEG של פאגים, בצע את כל השלבים בזהירות כדי למקסם את תפוקת הפאגים ולטפל בפאג המחודש ביסודיות עם כלורופורם כדי להסיר כמה שיותר מזהמי PEG ותרבית מדיה לפני השימוש והאחסון של פאגים.
לאחר שבדיקת ההתמרה בוצעה בהצלחה והמתמר אומת, שיבוטים אלה זמינים לענות על השאלות הדורשות בורליה בורגדורפרי מהונדסת גנטית. יש לקוות שפיתוח טכניקה זו יאפשר לחוקרים לבצע מניפולציות גנטיות בזני בורליה בורגדורפרי, שעבורם קשה כיום להכניס דנ"א באמצעות אלקטרופורציה.
