Dieses Protokoll ist bedeutsam, weil es ein weiteres wichtiges Werkzeug zur Analyse der Molekularbiologie des Borreliose-Wirkstoffs Borrelia burgdorferi beschreibt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie durch die Verwendung der Phagentransduktion eine alternative Methode zur Einführung von DNA in die Borrelia burgdorferi bietet, ohne dass ein elektrischer Impuls wie bei der Elektroporation erforderlich ist. Mit dieser Methode könnten weitere Einblicke in die molekularen Mechanismen von Borrelia burgdorferi gewonnen werden, um in ihrem enzootischen Zyklus zu persistieren und letztendlich Lyme-Borreliose beim Menschen zu verursachen.
Um zu beginnen, inokulieren Sie 150 Mikroliter des entsprechenden Borrelia burgdorferi-Klons in 15 Milliliter BSK in dicht verschlossenen sterilen konischen Zentrifugenröhrchen für das Transduktionsprotokoll. Dann ergänzen Sie das Medium mit der entsprechenden Konzentration von Antibiotika oder einer Kombination von Antibiotika für die Selektion und Erhaltung heterologer DNA innerhalb des Borrelia burgdorferi-Klons und inkubieren Sie die Probe bei 33 Grad Celsius. Nachdem die Kultur erwachsen ist, zentrifugieren Sie das entsprechende Kulturvolumen bei 6.000 G für 10 Minuten.
Nach dem Dekantieren des Überstands das Pellet in vier Milliliter bei frischem BSK resuspendieren und die Probe in das kleinste verfügbare sterile Röhrchen überführen, um die Probe mit minimalem Kopfraum aufzunehmen. Fügen Sie dann die entsprechende Menge des induzierenden Mittels zu der empfohlenen Konzentration hinzu, basierend auf einem Kulturvolumen von vier Millilitern, um die Phagenproduktion zu induzieren, verschließen Sie das Röhrchen fest und mischen Sie gründlich. Inkubieren Sie die Probe bei 33 Grad Celsius für zwei bis vier Stunden.
Anschließend wird die Probe in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Zentrifugieren Sie die Probe bei 6.000 G für 10 Minuten. Nach dem Dekantieren des Überstands das Zellpellet in 15 Milliliter BSK resuspendieren.
Ergänzen Sie die vorbereitete Kultur mit der entsprechenden im Manuskript beschriebenen Antibiotikakonzentration, während Sie die Probe bei 33 Grad Celsius für 72 bis 96 Stunden inkubieren. Um Lösungen für die PEG-Fällung herzustellen, werden 500 Milliliter fünfmolares Natriumchlorid, 500 Milliliter 40% PEG und 100 Milliliter Suspensionsmedium hergestellt, wie im Manuskript beschrieben. Zum Sterilisieren die Lösung autoklavieren, vor Gebrauch abkühlen und Raumtemperatur oder vier Grad Celsius lagern.
Für die PEG-Fällung von Phagen aus dem Spender-Borrelia burgdorferi-Klon nach 72 bis 96 Stunden Inkubation zentrifugieren Sie die Proben bei 8.000 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand in ein sauberes, 50-Milliliter-konisches Rohr und entsorgen Sie das Zellpellet. Fügen Sie fünfmoliges Natriumchlorid zu einer Endkonzentration von einem Molaren hinzu.
Nach dem guten Mischen eine Stunde lang bei Raumtemperatur vorsichtig schaukeln. Zentrifugieren Sie die Proben bei 8.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Dekantieren des Überstands in ein sauberes 50-Milliliter-konisches Röhrchen, wie zuvor demonstriert, 40% PEG-8000-Lösung zum Überstand auf eine Endkonzentration von 10% hinzufügenGut mischen und länger als eine Stunde bis über Nacht auf Eis legen.
Zentrifugieren Sie die Proben bei 8.000 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius, wie zuvor demonstriert. Entsorgen Sie den Überstand und entfernen Sie so viel überschüssige Flüssigkeit wie möglich, ohne ein Pellet zu verlieren, das die Phagenpartikel enthält. Resuspendieren Sie das Pellet in einem minimalen Volumen des Suspensionsmediums mit dem Suspensionsmedium, um die Seite der Flasche abzuwaschen und mögliche Phagenpartikel zu sammeln.
Behandeln Sie die gewonnene Phagenprobe mit einem gleichen Volumen Chloroform, basierend auf dem Volumen der Resuspension. Die Probe gut mischen und bei 8.000 g 10 Minuten zentrifugieren. Entfernen Sie dann die wässrige Schicht in ein sauberes Rohr und vermeiden Sie eine der dicken Grenzflächenschichten.
Nach Bestimmung des gewonnenen Volumens wird die Probe nach der ersten Chloroformbehandlung erneut mit einer Menge Chloroform behandelt, die 10 % dieses Volumens entspricht. Übertragen Sie die wässrige Schicht in ein sauberes Röhrchen und achten Sie darauf, eine der Grenzflächen oder organischen Schichten zu vermeiden. Verwenden Sie den Phagen sofort oder lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius.
Nach der Vorbereitung von Borrelia burgdorferi-Kulturen zur Verwendung als Empfänger in Transduktionsassays, wie zuvor demonstriert, zentrifugieren Sie das Kulturvolumen bei 6.000 G für 10 Minuten. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 14,5 Milliliter frischem BSK. Fügen Sie der Kultur des Empfängerklons weniger als oder gleich 500 Mikroliter PEG-gefällte Phagenprobe hinzu.
Nach dem guten Mischen 72 bis 96 Stunden bei 33 Grad Celsius inkubieren. Führen Sie die Auswahl der Transduktanten durch Festphasenbeschichtung nach dem Mischen mit PEG-gefälltem Phagen durch, wie im Manuskript beschrieben. Überprüfen Sie je nach Hintergrund des Empfängerklons, ob die Kolonien innerhalb der Agarose nach 10 bis 21 Tagen Inkubation auf den Selektionsplatten erscheinen.
Wählen Sie mindestens 5 bis 10 Kolonien, die in Gegenwart beider Antibiotika mit sterilisierter 5,75-Zoll-Borosilikatpipette auf dem Teller wachsen, und impfen Sie sie mit dem entsprechenden Antibiotikum in 1,5 Milliliter BSK. Die PCR-Amplifikation der Gene wurde an 10 der Klone durchgeführt, die für Kanamycin- und Gentamycinresistenz kodieren. Das Kanamycin-Resistenzgen konnte vom Spender c1673 und den potenziellen Transduktanten, aber nicht vom Empfänger c1706 amplifiziert werden.
In ähnlicher Weise könnte das Gentamycin-Resistenzgen vom Empfänger c1706 und den potenziellen Transduktanten, aber nicht vom Spender amplifiziert werden, was Transduktionsereignisse darstellt. Es sollte gezeigt werden, dass die Kanamycinresistenzkassette von 5BB1 vom Spender in den Empfänger übertragen wurde. Der Hintergrund der Transduktanten wurde mit Hilfe von dehnungsspezifischen Markern bestimmt.
Der c1673-Klon und der CA-112A-Hintergrund kodieren spezifische Amplikone vier, fünf und sechs, während c1706, das einen B31-Hintergrund mit hohem Durchgang hat, dies nicht tut. In ähnlicher Weise fehlten den Transduktanten eins und zwei die Amplikone vier, fünf und sechs, was zeigt, dass die Klone den c1706-Hintergrund haben und das Kanamycin-Resistenzgen von c1673 erworben haben. Führen Sie für die PEG-Fällung von Phagen alle Schritte sorgfältig durch, um die Ausbeute an Phagen zu maximieren, und behandeln Sie den resuspendierten Phagen gründlich mit Chloroform, um so viel PEG und Kulturmedienverunreinigungen wie möglich vor der Verwendung und Lagerung von Phagen zu entfernen.
Sobald der Transduktionsassay erfolgreich durchgeführt und das Transduktant verifiziert wurde, stehen diese Klone zur Verfügung, um die Fragen zu beantworten, die genetisch veränderte Borrelia burgdorferi erfordern. Die Entwicklung dieser Technik wird es den Forschern hoffentlich ermöglichen, Borrelia burgdorferi-Stämme genetisch zu manipulieren, für die die Einführung von DNA durch Elektroporation derzeit schwierig ist.
