このプロトコルは、ライム病剤ボレリア・ブルグドルフェリの分子生物学を解剖するための別の重要なツールを説明しているので重要である。この技術の主な利点は、ファージ形質導入を使用することにより、エレクトロポレーションのように電気パルスの適用を必要とせずにボレリア・ブルグドルフェリにDNAを導入するための代替方法を提供することである。この方法は、ボレリア・ブルグドルフェリがその風土病サイクルに持続し、最終的にヒトにライム病を引き起こすために使用する分子メカニズムへのさらなる洞察を提供するために使用できます。
まず、150マイクロリットルの適切なボレリア・ブルグドルフェリクローンを、形質導入プロトコル用の密閉された滅菌円錐形遠心チューブ内の15ミリリットルのBSKに接種します。次に、ボレリア・ブルグドルフェリクローン内の異種DNAの選択と維持のために、適切な濃度の抗生物質または抗生物質の組み合わせを培地に補給し、摂氏33度でサンプルをインキュベートします。培養物が成長した後、適切な量の培養液を6, 000 Gで10分間遠心分離します。
上清をデカントした後、新鮮なBSKでペレットを4ミリリットルに再懸濁し、最小限のヘッドスペースでサンプルを保持するために利用可能な最小の滅菌チューブにサンプルを移します。次に、ファージ産生を誘導するために、培養容量4ミリリットルに基づく推奨濃度に適量の誘導剤を添加し、チューブをしっかりと蓋をして、完全に混合します。サンプルを摂氏33度で2〜4時間インキュベートします。
次に、サンプルを15ミリリットルの遠沈管に移します。サンプルを6, 000 Gで10分間遠心分離します。上清をデカントした後、細胞ペレットを15ミリリットルのBSKに再懸濁します。
サンプルを摂氏33度で72〜96時間インキュベートしながら、原稿に記載されている適切な抗生物質濃度で準備した培養物を補充します。PEG沈殿用の溶液を調製するには、原稿に記載されているように、500ミリリットルの5モル塩化ナトリウム、500ミリリットルの40%PEG、および100ミリリットルの懸濁培地を準備します。滅菌するには、溶液をオートクレーブし、使用前に冷却し、室温または摂氏4度で保管します。
ドナーのボレリア・ブルグドルフェリクローンからのファージのPEG沈殿の場合、72〜96時間のインキュベーション後、サンプルを摂氏4度で20分間8, 000 Gで遠心分離します。上清を清潔な50ミリリットルの円錐管にデカントし、細胞ペレットを廃棄します。5モルの塩化ナトリウムを1モルの最終濃度まで加えます。
よく混ぜた後、室温で1時間穏やかに揺り動かします。サンプルを 8 , 000 G で摂氏 4 度で 10 分間遠心分離します。前に示したように上清をきれいな50ミリリットルの円錐管にデカントした後、上清に40%PEG-8000溶液を最終濃度10%まで加えますよく混ぜ、一晩まで1時間以上氷の上に置きます。
前述のように、摂氏4度で20分間、8, 000 Gでサンプルに遠心分離します。上清を廃棄し、ファージ粒子を含むペレットを失うことなく、できるだけ多くの余分な液体を取り除きます。懸濁培地を使用してペレットを最小量の懸濁培地に再懸濁し、ボトルの側面を洗い流し、潜在的なファージ粒子を収集します。
回収したファージサンプルを、再懸濁液の量に基づいて等量のクロロホルムで処理します。サンプルをよく混合し、8, 000 Gで10分間遠心分離します。次に、水層をきれいなチューブに除去し、厚い界面層のいずれかを避けます。
回収された体積を決定した後、最初のクロロホルム処理に続いて、その体積の10%に等しい量のクロロホルムでサンプルを再度処理する。水層をきれいなチューブに移し、界面や有機層を避けます。ファージをすぐに使用するか、摂氏4度で保存してください。
以前に実証したように、形質導入アッセイでレシピエントとして使用するボレリア・ブルグドルフェリ培養物を調製した後、培養液を6, 000 Gで10分間遠心分離します。上清をデカントし、ペレットを14.5ミリリットルの新鮮なBSKに再懸濁します。 500マイクロリットル以下のPEG沈殿ファージサンプルをレシピエントクローンの培養物に加えます。
よく混合した後、摂氏33度で72〜96時間インキュベートします。原稿に記載されているようにPEG沈降ファージと混合した後に固相プレーティングによる形質導入体の選択を行う。レシピエントクローンのバックグラウンドに応じて、10〜21日間のインキュベーション後に、選択プレート上のアガロース内にコロニーが現れることを確認します。
滅菌綿栓の5.75インチホウケイ酸ピペットを使用して、両方の抗生物質の存在下でプレート上で成長する少なくとも5〜10個のコロニーを選び、適切な抗生物質を含む1.5ミリリットルのBSKに接種します。遺伝子のPCR増幅は、カナマイシンおよびゲンタマイシン耐性をコードする10個のクローンに対して行った。カナマイシン耐性遺伝子は、ドナーc1673および潜在的な形質導入体から増幅することができたが、レシピエントc1706からは増幅できなかった。
同様に、ゲンタマイシン耐性遺伝子は、レシピエントc1706および潜在的な形質導入体から増幅され得るが、ドナーからは増幅されず、形質導入事象を表す。カナマイシン耐性カセットがドナーからレシピエントへ5BB1によって形質導入されたことを実証する。形質導入体のバックグラウンドは、菌株特異的マーカーを用いて決定した。
c1673クローンとCA-112Aバックグラウンドは特定のアンプリコン4、5、および6をエンコードしますが、高継代B31バックグラウンドを持つc1706はエンコードしません。同様に、形質導入体1および2はアンプリコン4、5および6を欠いており、クローンがc1706バックグラウンドを有し、c1673からカナマイシン耐性遺伝子を獲得したことを示している。ファージのPEG沈殿については、ファージの収量を最大化するためにすべてのステップを慎重に実行し、再懸濁したファージをクロロホルムで完全に処理して、ファージの使用および保存前にできるだけ多くのPEGおよび培地汚染物質を除去します。
形質導入アッセイが正常に実行され、形質導入剤が検証されると、これらのクローンは、遺伝子組み換えボレリア・ブルグドルフェリを必要とする質問に答えるために利用可能になります。この技術の開発により、エレクトロポレーションによるDNAの導入が現在困難なボレリア・ブルグドルフェリ株を遺伝子操作できるようになることが期待されます。
