Ce protocole est important car il décrit un autre outil important pour disséquer la biologie moléculaire de l’agent de la maladie de Lyme Borrelia burgdorferi. Le principal avantage de cette technique est qu’en utilisant la transduction de phage, elle fournit une méthode alternative pour introduire l’ADN dans le Borrelia burgdorferi sans nécessiter l’application d’une impulsion électrique, comme dans l’électroporation. Cette méthode pourrait être utilisée pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires utilisés par Borrelia burgdorferi pour persister dans son cycle enzootique et finalement causer la maladie de Lyme chez l’homme.
Pour commencer, inoculez 150 microlitres du clone approprié de Borrelia burgdorferi dans 15 millilitres de BSK dans des tubes centrifugeuses coniques stériles étroitement coiffés pour le protocole de transduction. Ensuite, complétez le milieu avec la concentration appropriée d’antibiotiques ou une combinaison d’antibiotiques pour la sélection et le maintien de l’ADN hétérologue dans le clone de Borrelia burgdorferi et incuber l’échantillon à 33 degrés Celsius. Une fois la culture développée, centrifuger le volume approprié de culture à 6 000 G pendant 10 minutes.
Après avoir décanté le surnageant, remettre la pastille en suspension dans quatre millilitres à BSK frais et transférer l’échantillon dans le plus petit tube stérile disponible pour contenir l’échantillon avec un minimum d’espace pour la tête. Ensuite, ajoutez la quantité appropriée d’agent inducteur à la concentration recommandée en fonction d’un volume de culture de quatre millilitres pour induire la production de phages, bouchez hermétiquement le tube et mélangez bien. Incuber l’échantillon à 33 degrés Celsius pendant deux à quatre heures.
Ensuite, transférez l’échantillon dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Centrifuger l’échantillon à 6 000 G pendant 10 minutes. Après avoir décanté le surnageant, remettre en suspension la pastille de cellule dans 15 millilitres de BSK.
Compléter la culture préparée avec la concentration d’antibiotique appropriée décrite dans le manuscrit, tout en incubant l’échantillon à 33 degrés Celsius pendant 72 à 96 heures. Pour préparer des solutions pour la précipitation du PEG, préparez 500 millilitres de chlorure de sodium à cinq molaires, 500 millilitres de PEG à 40% et 100 millilitres de milieu de suspension comme décrit dans le manuscrit. Pour stériliser, autoclaver la solution, refroidir avant utilisation et conserver la température ambiante ou quatre degrés Celsius.
Pour la précipitation PEG du phage du clone donneur de Borrelia burgdorferi, après 72 à 96 heures d’incubation, centrifuger les échantillons à 8 000 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Décanter le surnageant dans un tube conique propre de 50 millilitres et jeter la pastille de cellule. Ajouter le chlorure de sodium à cinq molaires à une concentration finale d’une molaire.
Après avoir bien mélangé, bercer doucement à température ambiante pendant une heure. Centrifuger les échantillons à 8 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir décanté le surnageant dans un tube conique propre de 50 millilitres comme démontré précédemment, ajouter une solution de 40% PEG-8000 au surnageant jusqu’à une concentration finale de 10%Bien mélanger et mettre sur la glace pendant plus d’une heure, jusqu’à toute la nuit.
Centrifuger vers les échantillons à 8 000 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, comme démontré précédemment. Jetez le surnageant et retirez autant de liquide en excès que possible sans perdre aucune pastille, qui contient les particules de phage. Remettez la pastille en suspension dans un volume minimal de milieu de suspension en utilisant le milieu de suspension pour laver le côté de la bouteille et recueillir toutes les particules de phage potentielles.
Traiter l’échantillon de phage récupéré avec un volume égal de chloroforme en fonction du volume de remise en suspension. Bien mélanger l’échantillon et centrifuger à 8 000 G pendant 10 minutes. Ensuite, retirez la couche aqueuse dans un tube propre, en évitant les couches d’interface épaisses.
Après avoir déterminé le volume récupéré, après le premier traitement au chloroforme, traiter à nouveau l’échantillon avec une quantité de chloroforme égale à 10 % de ce volume. Transférer la couche aqueuse dans un tube propre tout en prenant soin d’éviter les couches d’interface ou organiques. Utilisez le phage immédiatement ou conservez-le à quatre degrés Celsius.
Après avoir préparé des cultures de Borrelia burgdorferi à utiliser comme receveur dans les essais de transduction comme démontré précédemment, centrifuger le volume de culture à 6 000 G pendant 10 minutes. Décanter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 14,5 millilitres de BSK frais. Ajouter moins de 500 microlitres d’échantillon de phage précipité par PEG à la culture du clone receveur.
Après avoir bien mélangé, incuber à 33 degrés Celsius pendant 72 à 96 heures. Effectuer la sélection des transducteurs par placage en phase solide après mélange avec un phage précipité de PEG comme décrit dans le manuscrit. En fonction des antécédents du clone receveur, vérifier que les colonies apparaissent dans l’agarose sur les plaques de sélection après 10 à 21 jours d’incubation.
Choisissez au moins 5 à 10 colonies qui poussent dans l’assiette en présence des deux antibiotiques à l’aide d’une pipette borosilicatée stérilisée de 5,75 pouces bouchée en coton et inoculez-les dans 1,5 millilitre de BSK avec l’antibiotique approprié. L’amplification par PCR des gènes a été réalisée sur 10 des clones codant pour la résistance à la kanamycine et à la gentamycine. Le gène de résistance à la kanamycine pourrait être amplifié à partir du donneur c1673 et des transductants potentiels, mais pas du receveur c1706.
De même, le gène de résistance à la gentamycine pourrait être amplifié à partir du receveur c1706 et des transductants potentiels, mais pas du donneur, représentant des événements de transduction. Démontrer que la cassette de résistance à la kanamycine a été transduite par 5BB1 du donneur au receveur. Le bruit de fond des transductants a été déterminé à l’aide de marqueurs spécifiques à la souche.
Le clone c1673 et l’arrière-plan CA-112A codent des amplicons spécifiques quatre, cinq et six, alors que c1706, qui a un arrière-plan B31 à passage élevé, ne le fait pas. De même, les transducteurs un et deux manquaient d’amplicons quatre, cinq et six, démontrant que les clones ont le fond c1706 et ont acquis le gène de résistance à la kanamycine à partir de c1673. Pour la précipitation du phage en PEG, effectuer toutes les étapes avec soin pour maximiser le rendement du phage et traiter soigneusement le phage remis en suspension avec du chloroforme afin d’éliminer autant de contaminants de PEG et de milieux de culture que possible avant l’utilisation et l’entreposage du phage.
Une fois que le test de transduction a été effectué avec succès et que le transducteur a été vérifié, ces clones sont alors disponibles pour répondre aux questions qui nécessitent Borrelia burgdorferi génétiquement modifié. Le développement de cette technique permettra, espérons-le, aux chercheurs de manipuler génétiquement les souches de Borrelia burgdorferi pour lesquelles l’introduction de l’ADN par électroporation est actuellement difficile.
