Этот протокол важен, потому что он описывает еще один важный инструмент для препарирования молекулярной биологии агента болезни Лайма Borrelia burgdorferi. Основным преимуществом этой методики является то, что, используя фаговую трансдукцию, она обеспечивает альтернативный метод введения ДНК в Borrelia burgdorferi, не требуя применения электрического импульса, как при электропорации. Этот метод может быть использован для обеспечения дальнейшего понимания молекулярных механизмов, используемых Borrelia burgdorferi, чтобы сохраниться в своем энзоотическом цикле и в конечном итоге вызвать болезнь Лайма у людей.
Для начала инокулируют 150 микролитров соответствующего клона Borrelia burgdorferi в 15 миллилитров BSK в плотно закрытых стерильных конических центрифужных трубках для протокола трансдукции. Затем дополните среду соответствующей концентрацией антибиотиков или комбинацией антибиотиков для отбора и поддержания гетерологичной ДНК в клоне Borrelia burgdorferi и инкубируйте образец при 33 градусах Цельсия. После того, как культура вырастет, центрифугируют соответствующий объем культуры в 6000 г в течение 10 минут.
После декантирования супернатанта повторно суспендируйте гранулу в четыре миллилитра в свежем BSK и перенесите образец в самую маленькую стерильную трубку, доступную для хранения образца с минимальным пространством головки. Затем добавьте соответствующее количество индуцирующего агента к рекомендуемой концентрации, основанной на объеме культуры в четыре миллилитра, чтобы индуцировать производство фага, плотно закройте трубку и тщательно перемешайте. Инкубируйте образец при температуре 33 градуса Цельсия в течение двух-четырех часов.
Затем перенесите образец в 15-миллилитровую центрифужную трубку. Центрифугируйте образец при 6 000 G в течение 10 минут. После декантирования супернатанта повторно суспендируют ячейку гранулы в 15 миллилитрах БСК.
Дополнить подготовленную культуру соответствующей концентрацией антибиотиков, описанной в рукописи, при этом инкубируя образец при температуре 33 градуса Цельсия в течение 72-96 часов. Для приготовления растворов для осаждения ПЭГ готовят 500 миллилитров пятимолярного хлорида натрия, 500 миллилитров 40% ПЭГ и 100 миллилитров суспензионной среды, как описано в рукописи. Для стерилизации раствор автоклавируйте, охладите перед использованием и храните комнатную температуру или четыре градуса Цельсия.
Для ПЭГ-осаждения фага из донорского клона Borrelia burgdorferi после 72-96 часов инкубации центрифугируют образцы при 8 000 г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Декантируйте супернатант в чистую 50-миллилитровую коническую трубку и утилизируйте гранулу ячейки. Добавьте пятимолярный хлорид натрия до конечной концентрации одного моляра.
После хорошего перемешивания аккуратно помешивать при комнатной температуре в течение одного часа. Центрифугируйте образцы при 8 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После декантирования супернатанта в чистую 50-миллилитровую коническую трубку, как показано ранее, добавьте 40%-ный раствор ПЭГ-8000 к супернатанту до конечной концентрации 10%Хорошо перемешайте и положите на лед более одного часа, вплоть до ночи.
Центрифуга к образцам при 8 000 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия, как было продемонстрировано ранее. Выбросьте супернатант и удалите как можно больше лишней жидкости без потери гранул, которые содержат частицы фага. Повторно суспендируйте гранулу в минимальном объеме суспензионной среды, используя суспензионную среду, чтобы промыть боковую часть бутылки и собрать любые потенциальные фаговые частицы.
Обработайте восстановленный образец фага равным объемом хлороформа на основе объема повторного суспензии. Хорошо перемешайте образец и центрифугируйте при 8 000 г в течение 10 минут. Затем удалите водный слой в чистую трубку, избегая любого из толстых слоев интерфейса.
После определения извлеченного объема, после первой обработки хлороформом, снова обработайте образец количеством хлороформа, равным 10% от этого объема. Перенесите водный слой в чистую трубку, соблюдая осторожность, чтобы избежать любого из интерфейсных или органических слоев. Используйте фаг немедленно или храните его при четырех градусах Цельсия.
После подготовки культур Borrelia burgdorferi для использования в качестве реципиента в трансдукционных анализах, как показано ранее, центрифугируют объем культуры в 6000 г в течение 10 минут. Декантируйте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 14,5 миллилитрах свежего BSK. Добавьте менее или равно 500 микролитрам осажденного ПЭГ образца фага в культуру клона-реципиента.
После хорошего перемешивания инкубировать при 33 градусах Цельсия в течение 72-96 часов. Выполняют отбор трансдуктантов твердофазным покрытием после смешивания с ПЭГ-осажденным фагом, как описано в рукописи. В зависимости от фона клона-реципиента, проверьте, появляются ли колонии в агарозе на селекционных пластинах после 10-21 дня инкубации.
Соберите по крайней мере от 5 до 10 колоний, которые растут на пластине в присутствии обоих антибиотиков, используя стерилизованную хлопковую 5,75-дюймовую боросиликатную пипетку и привите их в 1,5 миллилитра BSK соответствующим антибиотиком. ПЦР-амплификация генов проводилась на 10 клонах, кодирующих резистентность к канамицину и гентамицину. Ген резистентности к канамицину может быть амплифицирован донором c1673 и потенциальными трансдуктантами, но не реципиентом c1706.
Аналогичным образом, ген устойчивости к гентамицину может быть амплифицирован от реципиента c1706 и потенциальных трансдуктантов, но не донора, представляя события трансдукции. Чтобы продемонстрировать, что кассета с резистентностью к канамицину была трансдуцирована 5BB1 от донора к реципиенту. Фон трансдуктантов определяли с помощью специфических для штаммов маркеров.
Клон c1673 и фон CA-112A кодируют определенные ампликоны четыре, пять и шесть, тогда как c1706, который имеет высокий проходной фон B31, этого не делает. Аналогичным образом, в трансдукантах один и два отсутствовали ампликоны четыре, пять и шесть, демонстрируя, что клоны имеют фон c1706 и приобрели ген устойчивости к канамицину от c1673. Для осаждения фагов пэг пэг тщательно выполните все шаги, чтобы максимизировать выход фага и тщательно обработайте повторно суспендированный фаг хлороформом, чтобы удалить как можно больше загрязняющих веществ ПЭГ и культуральной среды перед использованием и хранением фагов.
После того, как анализ трансдукции был успешно выполнен и трансдуктант проверен, эти клоны доступны для ответа на вопросы, которые требуют генетически модифицированного Borrelia burgdorferi. Мы надеемся, что разработка этого метода позволит исследователям генетически манипулировать штаммами Borrelia burgdorferi, для которых введение ДНК посредством электропорации в настоящее время затруднено.
