이 프로토콜은 라임 병 에이전트 Borrelia burgdorferi의 분자 생물학을 해부하기위한 또 다른 중요한 도구를 설명하기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 파지 형질 도입을 사용하여 전기 천공에서와 같이 전기 펄스를 적용하지 않고도 Borrelia burgdorferi에 DNA를 도입하는 대체 방법을 제공한다는 것입니다. 이 방법은 Borrelia burgdorferi가 동물주기에서 지속되고 궁극적으로 인간에게 라임 병을 일으키는 데 사용하는 분자 메커니즘에 대한 추가 통찰력을 제공하는 데 사용될 수 있습니다.
시작하려면 형질도입 프로토콜을 위해 단단히 캡이 있는 멸균 원추형 원심분리 튜브에 150마이크로리터의 적절한 Borrelia burgdorferi 클론을 15밀리리터의 BSK에 접종합니다. 그런 다음 Borrelia burgdorferi 클론 내에서 이종 DNA의 선택 및 유지를 위해 적절한 농도의 항생제 또는 항생제 조합으로 배지를 보충하고 섭씨 33도에서 샘플을 배양합니다. 배양 물이 성장한 후, 적절한 양의 배양 물을 6, 000 G에서 10 분 동안 원심 분리한다.
상청액을 디캔팅한 후 펠릿을 새 BSK에서 4밀리리터에 재현탁하고 최소한의 헤드 공간으로 샘플을 고정할 수 있는 가장 작은 멸균 튜브로 샘플을 옮깁니다. 그런 다음 파지 생산을 유도하기 위해 배양 부피 4ml을 기준으로 권장 농도로 적절한 양의 유도제를 첨가하고 튜브를 단단히 캡핑하고 완전히 혼합합니다. 샘플을 섭씨 33도에서 2-4시간 동안 배양합니다.
그런 다음 샘플을 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 샘플을 6, 000 G에서 10 분 동안 원심 분리한다. 상청액을 디캔팅한 후 세포 펠릿을 BSK 15ml에 재현탁합니다.
준비된 배양 물을 원고에 설명 된 적절한 항생제 농도로 보충하고 샘플을 섭씨 33도에서 72-96 시간 동안 배양합니다. PEG 침전을위한 용액을 준비하기 위해, 원고에 설명 된대로 5 몰 염화나트륨 500 밀리리터, 40 % PEG 500 밀리리터 및 현탁 배지 100 밀리리터를 준비한다. 살균하려면 용액을 오토 클레이브하고 사용하기 전에 식힌 다음 실온 또는 섭씨 4도를 보관하십시오.
공여체 보렐리아 부르그도르페리 클론으로부터의 파지의 PEG 침전을 위해, 72 내지 96 시간의 인큐베이션 후, 샘플을 섭씨 4도에서 20분 동안 8, 000 G에서 원심분리한다. 상청액을 깨끗한 50밀리리터 원추형 튜브에 넣고 세포 펠릿을 폐기합니다. 5몰 염화나트륨을 최종 농도 1몰에 추가합니다.
잘 섞은 후 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔듭니다. 샘플을 섭씨 4도에서 10 분 동안 8, 000 G에서 원심 분리합니다. 이전에 시연된 대로 상청액을 깨끗한 50밀리리터 원추형 튜브에 디캔팅한 후 40%PEG-8000 용액을 상청액에 최종 농도인 10%Mix 웰로 추가하고 최대 밤새도록 1시간 이상 얼음에 놓습니다.
이전에 시연 된대로 섭씨 4도에서 20 분 동안 8, 000G의 샘플을 원심 분리합니다. 상청액을 버리고 파지 입자가 포함된 펠릿을 잃지 않고 가능한 한 많은 과잉 액체를 제거합니다. 현탁 배지를 사용하여 최소 부피의 현탁 배지에 펠릿을 재현탁하여 병의 측면을 씻어내고 잠재적인 파지 입자를 수집합니다.
회수된 파지 샘플을 재현탁 부피를 기준으로 동일한 부피의 클로로포름으로 처리한다. 샘플을 잘 혼합하고 8, 000 G에서 10 분 동안 원심 분리합니다. 이어서, 수성 층을 깨끗한 튜브로 제거하여, 임의의 두꺼운 계면층을 피한다.
회수된 부피를 결정한 후, 첫 번째 클로로포름 처리 후, 해당 부피의 10%에 해당하는 양의 클로로포름으로 샘플을 다시 처리한다. 계면 또는 유기 층을 피하도록 주의하면서 수성 층을 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 파지를 즉시 사용하거나 섭씨 4도에서 보관하십시오.
이전에 입증 된 바와 같이 형질 도입 분석에서 수용자로서 사용될 Borrelia burgdorferi 배양물을 제조 한 후, 배양 부피를 6, 000 G에서 10 분 동안 원심 분리한다. 상청액을 따라 내고 펠릿을 14.5 밀리리터의 신선한 BSK에 재현 탁시킨다. 500 마이크로리터 이하의 PEG-침전된 파지 샘플을 수용자 클론의 배양물에 첨가한다.
잘 섞은 후 섭씨 33도에서 72-96 시간 동안 배양하십시오. 원고에 기재된 바와 같이 PEG-침전된 파지와 혼합한 후에 고체상 도금에 의한 형질전환체의 선택을 수행한다. 수용자 클론의 배경에 따라, 배양 10 내지 21일 후에 콜로니가 선택 플레이트의 아가로스 내에 나타나는지 확인한다.
멸균 된면 플러그 5.75 인치 붕규산 피펫을 사용하여 두 항생제가있는 상태에서 플레이트에서 자라는 최소 5-10 개의 콜로니를 선택하고 적절한 항생제로 BSK 1.5ml에 접종하십시오. 유전자의 PCR 증폭은 카나마이신 및 겐타마이신 내성을 코딩하는 클론 중 10개에 대해 수행하였다. 카나마이신 내성 유전자는 공여체 c1673 및 잠재적 형질도입체로부터 증폭될 수 있지만 수용자 c1706은 증폭될 수 없다.
유사하게, 겐타 마이신 내성 유전자는 수용자 c1706 및 잠재적 형질 도입체로부터 증폭 될 수 있지만 형질 도입 사건을 나타내는 기증자는 증폭되지 않을 수 있습니다. 카나마이신 내성 카세트가 5BB1에 의해 공여자로부터 수용자 내로 형질도입되었음을 입증한다. 형질도입체의 배경은 균주-특이적 마커를 사용하여 결정하였다.
c1673 클론과 CA-112A 배경은 특정 앰플리콘 4, 5, 6을 인코딩하는 반면, 높은 통로 B31 배경을 가진 c1706은 인코딩하지 않습니다. 유사하게, 형질도입체 1 및 2에는 앰플리콘 4, 5 및 6이 누락되어 클론이 c1706 배경을 가지며 c1673으로부터 카나마이신 내성 유전자를 획득했음을 입증합니다. 파지의 PEG 침전을 위해, 파지의 수율을 최대화하기 위해 모든 단계를 신중하게 수행하고 파지 사용 및 보관 전에 가능한 한 많은 PEG 및 배양 배지 오염 물질을 제거하기 위해 재현탁된 파지를 클로로포름으로 완전히 처리하십시오.
형질도입 분석이 성공적으로 수행되고 형질도입제가 검증되면 이러한 클론을 사용하여 유전자 변형 Borrelia burgdorferi가 필요한 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 개발은 연구자들이 현재 전기 천공을 통한 DNA 도입이 어려운 Borrelia burgdorferi 균주를 유 전적으로 조작 할 수있게 해줄 것입니다.
