تصف هذه الطريقة نموذجا جديدا للفأر لدراسة انتقال المكورات الرئوية من مستعمر بدون أعراض إلى ممرض مسبب للأمراض أثناء العدوى الفيروسية. إنه يحاكي بشكل وثيق ما يحدث في البشر. يمكن أن يكون هذا النموذج أداة مهمة لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة ضد الالتهاب الرئوي بالمكورات الرئوية الثانوية في المضيفين المعرضين للإصابة.
هذا النموذج يعيد إنتاج قابلية الشيخوخة. لذلك ، يمكن استخدامه لفهم جوانب المضيف التي تصبح معيبة مع تقدم العمر والسماح لنا بتخصيص خيارات العلاج للمضيفين المسنين الضعفاء. يمثل نمو الأغشية الحيوية للمكورات الرئوية تحديا لأن السلالات المختلفة تستغرق فترات زمنية مختلفة.
نصيحتي هي محاولة زراعة الأغشية الحيوية قبل تنفيذ الدراسة على الحيوانات. بمجرد أن تصبح خلايا H292 متقاربة بنسبة 100٪ ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. ثم أضف 250 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد لكل بئر لإصلاح الخلايا واحتضانها لمدة ساعة واحدة على الجليد أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية.
سلالة Strake streptococcus pneumoniae ذات أهمية على صفيحة أجار الدم وتحضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، قم بتلقيح البكتيريا من اللوحة إلى وسائط جديدة محددة كيميائيا أو CDM plus Oxyrase عن طريق غسل البكتيريا من اللوحة عن طريق إضافة ملليلتر واحد من CDM plus Oxyrase ورفع المستعمرات البكتيرية برفق باستخدام جانب طرف ماصة واحد ملليلتر ، مع الحرص على عدم كشط الآجار. تمييع الثقافة البكتيرية في CDM بالإضافة إلى Oxyrase إلى OD 600 بدءا من 0.05.
ثم تنمو البكتيريا في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر مغطى بشكل فضفاض عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى يتم الوصول إلى OD من 0.2. الدوامة التالية أنبوب الثقافة البكتيرية. بذر 0.5 ملليلتر من المزرعة على خلايا H292 الثابتة وإضافة 0.5 ملليلتر أخرى من CDM بالإضافة إلى وسط Oxyrase لكل بئر.
أضف CDM بالإضافة إلى Oxyrase إلى آبار التحكم الخالية من البكتيريا. احتضان اللوحة لمدة 48 ساعة عند 34 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. كل 12 ساعة ، بعد البذر الأولي ، استبدل برفق 0.5 ملليلتر من الوسط بآلية التنمية النظيفة الطازجة بالإضافة إلى Oxyrase.
احرص على عدم تعطيل تكوين الأغشية الحيوية. تحقق من الجزء السفلي من اللوحة بحثا عن الأغشية الحيوية وابحث عن زيادة الغيوم مع مرور الوقت بسبب نمو الأغشية الحيوية. بعد 48 ساعة ، قم بإزالة المادة الطافية وغسل الغشاء الحيوي مرتين باستخدام ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني.
ثم أعد تعليق الغشاء الحيوي في ملليلتر واحد من آلية التنمية النظيفة الطازجة والماصة لأعلى ولأسفل بقوة لرفع الغشاء الحيوي. لكل سلالة بكتيرية ، قم بتجميع الثقافة من جميع الآبار في أنبوب 50 ملليلتر. تخلط جيدا عن طريق إمالة الأنبوب المغطى بإحكام برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات.
بعد ذلك ، أضف 40٪ من الجلسرين و CDM بأحجام متساوية لتحقيق تعليق بكتيري بتركيز نهائي يبلغ 20٪ جلسرين. قسمة ملليلتر واحد في أنبوب طرد مركزي صغير ، وتجميد فلاش على الثلج الجاف ، وتوفير في ناقص 80 درجة مئوية. قم بإذابة الأغشية الحيوية المزروعة على الجليد وقم بتدويرها عند 1،700 جم لمدة خمس دقائق.
قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها بعناية دون تعطيل الحبيبات. ثم اغسل الحبيبات عن طريق تعليقها في ملليلتر واحد من PBS وقم بتدويرها مرة أخرى. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات بالحجم المطلوب للوصول إلى التركيز المطلوب.
قم بتلقيح الفأر الأسود C57 المكون من ستة ذكور داخل الأنف بخمس مرات 10 إلى وحدات تشكيل المستعمرة السادسة أو CFU عن طريق سحب خمسة ميكرولترات من اللقاح المخفف في كل ناريس. بعد التلقيح ، أمسك الماوس بإحكام ، وثبت الرأس حتى يتم استنشاق الحجم. بمجرد ذوبان الفيروس ، قم بتخفيف الفيروس في برنامج تلفزيوني إلى التركيز المطلوب.
ضع مادة تشحيم العيون على عيون الفأر قبل التخدير. تصيب الفأر المخدر على الفور ب 50 ميكرولترا من 20 وحدة تشكيل البلاك ، أو PFU ، من فيروس الأنفلونزا A أو IAV داخل القصبة الهوائية باستخدام ملاقط حادة لسحب اللسان من الفم وسحب حجم السائل أسفل القصبة الهوائية. بعد الشفاء ، تلقيح 10 ميكرولتر من 200 PFU من IAV باستخدام طريقة التلقيح الموضحة سابقا.
لجمع الرئة ، باستخدام مقص التشريح ، قم بقطع جوانب القفص الصدري المكشوف واسحب الأضلاع برفق نحو رأس الفأر لكشف القلب. أدخل إبرة قياس 25 متصلة بحقنة سعة 10 ملليلتر مملوءة مسبقا ب PBS في البطين الأيمن وابدأ في التعتيم ببطء. ابحث عن تبييض الرئتين كمؤشر على التروية الناجحة.
احمر ببطء لتجنب كسر الأنسجة الرئوية. ارفع القلب بالملقط وقم بعمل قطع لفصل الرئتين والقلب. بمجرد الانفصال ، التقط جميع فصوص الرئة بالملقط واشطفها في طبق به برنامج تلفزيوني معقم لإزالة أي دم متبقي.
في طبق بتري ، يفرم الرئة إلى قطع صغيرة ويخلط جيدا. قم بإزالة نصف مزيج الرئة لتحديد CFU البكتيري أو PFU الفيروسي ووضعه في أنبوب دائري القاع 15 ملليلتر مملوء مسبقا ب 0.5 ملليلتر من PBS للتجانس. قم بإزالة النصف الآخر من الرئة لقياس التدفق الخلوي ووضعه في لوحة 24 بئرا معالجة بزراعة الأنسجة مع كل بئر مملوء مسبقا ب 0.5 ملليلتر من RP10.
اتركيه في درجة حرارة الغرفة حتى المعالجة. لتجانس الأنسجة التي تم جمعها ، قم بتنظيف مسبار الخالط عن طريق وضعه في 70٪ من الإيثانول وتشغيل الخالط بقوة 60٪ لمدة 30 ثانية. كرر هذه الخطوة في الماء المعقم لمدة 10 ثوان.
تجانس كل الأنسجة لمدة دقيقة واحدة. لتعداد الأرقام البكتيرية ، التخفيفات التسلسلية لوحة على لوحات أجار الدم. لحساب إجمالي CFU ، استخدم 10 ميكرولتر للوحة ولاحظ الحجم النهائي بالملليلتر لكل عينة.
صفيحة عينات البلعوم الأنفي على ألواح أجار الدم تستكمل بثلاثة ميكروغرام لكل ملليلتر جنتاميسين لتحديد نمو S الرئوية مع تثبيط نمو الكائنات الحية الدقيقة الأخرى. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون. لقياس التدفق الخلوي ، أضف 500 ميكرولتر من محلول الهضم إلى كل بئر من صفيحة 24 بئرا تحتوي على عينة من الرئة.
احتضان اللوحة لمدة 45 دقيقة إلى ساعة واحدة. بعد ذلك ، باستخدام ماصة صغيرة P-1000 ، حرك الرئتين المهضومتين وضعهما على الفلتر. ثم استخدم مكبس حقنة ثلاثة ملليلتر لهرس العينة.
يؤدي نمو الأغشية الحيوية للقاح S.pneumoniae إلى نقل متسق للمكورات الرئوية يقتصر على البلعوم الأنفي مع تجنب الانتشار المنهجي. كان عرض المرض في الفئران المصابة بعدوى S pneumoniae IAV يعتمد على السلالة البكتيرية. في حين لم يكن هناك فرق كبير في أعداد البكتيريا من البلعوم الأنفي بين أي من السلالات ، S الرئوية ، TIGR4 ، و D39 ، ولكن ليس EF3030 انتشرت إلى الرئتين لمدة 48 ساعة بعد الإصابة IAV.
40٪ من الفئران المصابة ب S pneumoniae TIGR4 أظهرت انتشارا بكتيريا إلى الرئتين ونصفها أصبح جراثيما. أظهرت الفئران المصابة ب S pneumoniae D39 انتشارا بنسبة 100٪ إلى الرئتين ونصف ذلك عانى من تجرثم الدم. في تتبع البقاء على قيد الحياة بشكل عام ، بغض النظر عن السلالة البكتيرية ، كان معدل بقاء الفئران المصابة بالعدوى المشتركة أقل بكثير من الفئران التي تم تحديها بشكل فردي مع S pneumoniae.
تم استخدام هذا النموذج أيضا لتقييم وجود خلايا مناعية مختلفة في الرئتين بعد عدوى IAV. أثارت السلالات البكتيرية D39 و TIGR4 زيادة كبيرة فوق خط الأساس في تدفق الخلايا المناعية الالتهابية من الدورة الدموية ، مثل العدلات والوحيدات ، في حين أن EF3030 لم تفعل ذلك. أثارت عدوى IAV وحدها زيادة كبيرة فوق خط الأساس في تدفق الخلايا المناعية مثل الخلايا القاتلة الطبيعية وخلايا جاما دلتا التائية.
تم إضعاف هذه الاستجابات المضادة للفيروسات بشكل كبير في الفئران المصابة عن طريق الأنف ب S pneumoniae قبل التحدي الفيروسي. في الفئران المصابة منفردة ، لم يختلف التتر الفيروسي بين الأفواج الصغيرة والمسنين. أظهرت الفئران المسنة علامات مرض مبكرة وأكثر حدة بشكل ملحوظ وماتت بشكل أسرع ، في غضون 24 ساعة ، في حين نجت الضوابط الصغيرة من العدوى بشكل أفضل.
يسمح لنا فصل النقل والمرض إلى خطوات متميزة بفحص كل من الاستجابة المناعية والعوامل البكتيرية و / أو الفيروسية المهمة في المراحل المختلفة من تطور المرض. نأمل أن يتم تكييف هذا النموذج من قبل مختبرات أخرى لدراسة التفاعلات الأخرى متعددة الميكروبات وتفاعلات مسببات الأمراض المضيفة خلال المراحل المختلفة من تطور المرض وعبر المضيفين المختلفين.
