Этот протокол имеет важное значение, поскольку он показывает пошаговую методологию выделения высокочистого эпителия матки из матки мыши для культуры органоидов эндометрия. Этот метод эффективно использует ферментативную и механическую диссоциацию для выделения эпителия матки. Методы были оптимизированы для установления, лечения и анализа органоидов эпителия эндометрия, полученных из изолированного эпителия.
Начните с размораживания гелевой матрицы на льду примерно за один-два часа перед использованием. Затем рассекните усыпленную мышь, сделав разрез средней линии на животе с помощью ножниц и аккуратно отшелушивая кожу, чтобы обнажить нижележащий перитонеальный слой. Найдите рога матки, осторожно отодвинув брюшные жировые подушечки в сторону, и удерживайте рога матки в шейном соединении, прежде чем разрезать их вдоль брыжеечного жира.
После рассечения матки мыши тщательно удалите жировую ткань из рога матки небольшими ножницами. После этого разрежьте каждый рог матки на небольшие фрагменты, каждый размером примерно от четырех до пяти миллиметров. Поместите все фрагменты матки из одной матки в один колодец из 24 лунок, содержащих 0,5 миллилитра 1% трипсина.
Затем инкубируют 24-луночную пластину в инкубаторе увлажненной культуры тканей при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно одного часа для ферментативного отделения эпителия эндометрия от нижележащей стромы. После инкубации перенесите фрагменты матки на 35-миллиметровую пластину культуры ткани, содержащую один миллилитр буферного раствора фосфатов Дульбекко или DPBS. Далее отделяем эпителий матки от маточной трубы под рассеченным микроскопом, удерживая один конец фрагмента матки щипцами и осторожно проводя кончиком пипетки продольно по фрагменту, выдавливая эпителий из другого конца маточной трубы.
Затем наблюдают за отделенными эпителиальными листами от фрагмента матки под рассеченным микроскопом. Затем аккуратно переложите все эпителиальные листы в ту же 1,5-миллилитровую трубку, используя одну миллилитровую пипетку. И гранулируют диссоциированные эпителиальные листы центрифугированием при 375 х г в течение пяти минут.
Осторожно удалите супернатант, не нарушая клеточную гранулу, и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 0,5 миллилитра 2,5 миллиграмма на миллилитр коллагеназы плюс два миллиграмма на миллилитр раствора ДНК. Пипетка вверх и вниз примерно 10 раз или до тех пор, пока не будет достигнута одноклеточная суспензия. Затем добавьте 0,5 миллилитра DMEM F/12 плюс 10% фетальной бычьей сыворотки или FBS плюс антибиотики и центрифугируйте клетки в течение пяти минут при 375 х г.
Удалите супернатант, повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре DMEM/ F12 плюс 10% FBS плюс антибиотики и центрифугируйте клетки. Поместите гелевую матрицу на лед, пока она не будет готова. Затем удалите супернатант из клеток центрифуги и повторно суспендируйте гранулу клетки, используя в 20 раз больший объем гелевой матрицы, не вводя пузырьки.
Дайте суспензии клеток гелевой матрицы осесть при комнатной температуре в течение примерно 10 минут. Как только суспензия клеток гелевой матрицы станет полутвердым гелем, используйте микропипетку P200 с широким отверстием 200 микролитровых наконечников и осторожно аспирируйте 25 микролитров суспензии клеток гелевой матрицы. Дозируйте три отдельных купола по 25 микролитров на лунку из 12-луночной пластины и дайте гелевой матрице отверждаться в течение 15 минут и инкубатору культуры увлажненной ткани при температуре 37 градусов Цельсия.
После того, как гелевая матрица отверждена, добавьте 750 микролитров органоидной среды к каждой скважине, содержащей купол гелевой матрицы, и инкубатор при 37 градусах Цельсия в инкубатор культуры увлажненной ткани. Фазоконтрастные изображения органоидов эндометрия мышей показали, что разделение эпителиальных и стромальных клеток дало образцы с загрязнением не более 10-15% противоположного типа клеток. Эпителиальные клетки эндометрия были собраны в органоиды в течение трех-четырех дней.
Секционные формалиновые фиксированные парафиновые встроенные органоиды эндометрия визуализировались пятнами гематоксилина и эозина, которые отображали единый слой эпителия и полые центры, просветы органоидов. Визуализация флуоресцентного микроскопа показала, что все клетки в органоидах были цитокератином 8-положительными и содержали DAPI, что указывает на то, что фиксация, встраивание и обработка органоидов эндометрия совместимы с иммуноокрашиванием на основе антител. Количественная ПЦР в реальном времени показала, что стимуляция 10 наномолярным эстрадиолом увеличивает экспрессию липокалина 2, лактоферрина и рецептора прогестерона в эпителиальных органоидах, что указывает на то, что эпителиальные органоиды эндометрия могут быть успешно использованы для измерения изменений экспрессии генов в ответ на эстрадиол.
Важно убедиться, что четкое разделение эпителия эндометрия получено на стадии механической диссоциации. Нужно уметь наблюдать эпителий, выходящий из маточной трубы. Другие методы включают установление эпителиальных органоидов путем инкапсуляции в гелевую матрицу.
При желании стромальный компартмент может быть дополнительно переварен для создания 3D эпителиальных стромальных кокультур. Метод может помочь ответить на вопросы о сигналах, контролирующих обновление эндометрия. Это может помочь в лечении заболеваний у женщин, таких как эндометриоз, потеря беременности и рак.
