يحدد هذا البروتوكول طرقا متطورة لتوليد بيانات تصوير عالية الدقة لتشخيص عيوب القلب الخلقية. نجري تقييمات وظيفية مع تخطيط صدى القلب الجنيني غير الغازية جنبا إلى جنب مع التشريح تليها المجهرية الأسقفية علم أمراض الأنسجة البؤري لتوليد مكدسات صور 2D التسلسلية وإعادة البناء 3D لتشخيص أمراض القلب التاجية الشامل. يمكن لهذه الطريقة توضيح التغيرات التشريحية التفصيلية ليس فقط في أمراض القلب الخلقية ، ولكن يمكن استخدامها أيضا للتحقيق في العيوب الخلقية الهيكلية في الأعضاء الأخرى بما في ذلك عيوب الوجه في الجمجمة ، وتشوهات الأطراف والهيكل العظمي ، وكذلك عيوب الدماغ والأعضاء الحشوية الأخرى.
سيتم توضيح هذه الإجراءات ميغان هولبروك وكارلا جوزمان وبيزهاو تشانغ وبنيامين جلينون ، وجميعهم باحثون من مختبرنا. بعد تحضير الماوس للإجراء ، قم بتسخين هلام الموجات فوق الصوتية إلى درجة حرارة الجسم وقم بتطبيقه بسخاء على منطقة التصوير. ثم ضع محول الطاقة على البطن الموجه في مستوى أفقي وحدد المثانة على الشاشة.
بمجرد تحديد المثانة ، امسح القحف من المثانة ، وابحث عن الجنين ، وحدد عمر الحمل عن طريق قياس التاج إلى طول الردف. بعد ذلك ، استخدم دوبلر ملون لتحليل تدفق الدم من القلب. للسماح باختراق المثبت في الأعضاء الداخلية ، قم بعمل شقوق في الصدر الجانبي والبطن باستخدام ملقط أو مقص تشريح واترك العينة تثبت لمدة 24 ساعة على الأقل في غرفة باردة.
ثم قم بإعداد البرنامج لحفظ الصور باسم ، بما في ذلك تحديد العينة وتكبير المجهر ومحتوى الصورة. ثبت العينة من خلال معصميها وكاحليها. قبل قطع الجلد على طول المحور المتوسط باتجاه الذيل ، ارفع الجلد في منتصف الرقبة باستخدام الملقط وقطع الجلد نحو كل من الإبطين بالمقص.
ثم قطع الجلد من السرة إلى الساقين. بعد تضمين العينات ، اضبط موضع عرض الليزر على مركز العينة على الشاشة واضبط مقبض التكبير / التصغير على 20x. لتحسين الدقة ، اضبط الكسب على 1،250 فولت.
قم بتكبير المنطقة الزرقاء باستخدام مقبض التركيز البؤري ، ثم أعد ضبط الكسب إلى 750 فولت تقريبا للتصوير. بعد ذلك ، قم بتبديل طريقة القطع إلى تلقائي. اضبط السماكة على حوالي 50 ميكرومتر وقم بتشغيل الشرائح.
توقف عن القطع عندما تكون الرئتان ومجرى الهواء في الأفق. اختر سمك قطع يتراوح بين ثمانية إلى 10 ميكرومتر وأوقف فتح العرض المباشر. افتح جهاز الاتصال Microtome لبدء التصوير.
تأكد من أن مجلد التخزين المؤقت فارغ قبل جمع الصور. أوقف مجموعة الصور عندما لا تكون البنية الصلبة مرئية. أخرج الملفات المخزنة المؤقتة في سلسلة صور TIFF واحدة.
لإعادة بناء الصور 3D ، اسحب ملفات الصور وأفلتها في برنامج معالجة الصور. بمجرد ظهور النافذة المنبثقة ، حدد الروابط أو الملفات المراد نسخها إلى قاعدة البيانات. بمجرد فتح الملف ، انقر فوق قائمة أدوات إعادة الإعمار 2D 3D من شريط الأدوات وحدد 3D MPR.
بالنسبة لدقة البكسل X ودقة البكسل Y، أدخل دقة الصورة عن طريق إعطاء التكبير/التصغير المستخدم أثناء تصوير ECM. بالنسبة للفاصل الزمني للشريحة ، أدخل سمك الشريحة المستخدم للقطع أثناء تصوير ECM. بعد ذلك ، استخدم أداة WWWL لضبط عرض النافذة ومستوى النافذة.
انقر واسحب الأداة على الصورة لأعلى لتقليل سطوع الصورة ولأسفل لزيادتها. انقر واسحب الأداة على الصورة إلى اليمين لتقليل تباين الصورة والكلمة اليسرى لزيادتها. اسحب الصور إلى المواضع المطلوبة باستخدام أداة التحريك.
استخدم أداة التكبير لتكبير الصورة أو تصغيرها وأداة التدوير لتدوير الصورة حسب الرغبة. الآن ، انقر واسحب المحور الملون للوحة الأولى. لاحظ كيف يؤدي تدوير هذا المحور إلى تغيير اتجاه اللوحتين الأخريين.
قم بتدوير محاور اللوحات الثلاثة حتى تمثل اللوحات الثلاث المناظر الإكليلية والسهمية والمستعرضة للعينة. بمجرد وضع اللوحات الثلاث وتوجيهها وإشراقها بشكل مناسب ، انقر فوق اللوحة التي تمثل المنظر الإكليلي. ثم انقر فوق تصدير الفيلم على الجانب الأيمن من شريط القوائم.
انقر فوق الدفعة واسحب أشرطة التمرير من وإلى لتشمل منطقة الاهتمام بأكملها. بالنسبة للفاصل الزمني ، حدد نفس خيار السمك واحفظ الفيديو الذي يشير إلى اتجاه المشاهدات. يظهر الصدى حاجزا بطينيا سليما بدون تحويلة داخل البطينات والشرايين الكبيرة ذات الصلة الطبيعية في السيطرة الطبيعية ، وهو ما أكده ECM.
يوضح المنظر الأمامي الاتصال بين LA و RA و LV و RV في كل من الصدى و ECM ، مما يشير إلى عيب الحاجز الأذيني البطيني. يوضح تدفق اللون التدفق عبر LV و RV مما يشير إلى عيب الحاجز البطيني. أظهر Echo و ECM منفذا مزدوجا للبطين الأيمن مع عيب في الحاجز البطيني بين LV و RV مع شرايين كبيرة جنبا إلى جنب.
يوضح التشخيص بالموجات فوق الصوتية للجذع الشرياني المستمر الاتصال بين LV و RV مع مجرى تدفق واحد يتجاوز كلا البطينين ، وهو ما أكده أيضا ECM في مرحلة E14.5. يمكن معالجة الأقسام التي تم جمعها من أنسجة ECM بشكل أكبر من أجل تلطيخ المناعة ، وتلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين وحتى استخراج الحمض النووي للتنميط الجيني والتنميط النسخي أو استخراج البروتين للتحليل البروتيني. يمكن معالجة الصور من إعادة البناء ثلاثية الأبعاد بشكل أكبر لتقييم المحيط الكمي مثل المساحة أو الحجم.
يعد التنميط الظاهري الدقيق لتحديد العيوب في تشريح القلب والأوعية الدموية أمرا ضروريا لإنشاء نماذج فئران معدلة وراثيا ومتحولة لأمراض القلب الخلقية لتوضيح الآليات المرضية لأمراض القلب الخلقية. هذا يمكن أن يؤدي إلى فرص محتملة لتطوير العلاجات والتدخل لتحسين النتائج السريرية في المرضى الذين يعانون من أمراض القلب الخلقية.
