该协议概述了生成高分辨率成像数据以诊断先天性心脏缺陷的尖端方法。我们通过无创胎儿超声心动图结合尸检进行功能评估，然后进行主教共聚焦显微镜组织病理学，以生成连续2D图像堆栈和3D重建，以进行全面的冠心病诊断。该方法不仅可以阐明先天性心脏病的详细解剖变化，还可以用于研究其他器官的结构出生缺陷，包括颅面缺陷，肢体和骨骼异常，以及大脑和其他内脏器官的缺陷。
展示这些程序的将是Meghan Holbrook，Carla Guzman，Peizhao Zhang和Benjamin Glennon，他们都是我们实验室的研究人员。准备好鼠标进行手术后，将超声凝胶加热至体温并将其大量涂抹在成像区域。然后将换能器放在水平面朝向的腹部，并在屏幕上识别膀胱。
一旦确定膀胱，从膀胱进行颅骨扫描，寻找胎儿，并通过测量冠到臀部长度来确定胎龄。接下来，使用彩色多普勒分析来自心脏的血流。为了使固定剂渗透到内部器官中，请使用镊子或解剖剪刀在侧胸和腹部切开切口，并使样本在冷藏室中固定至少24小时。
然后设置软件以保存带有名称的图像，包括样品的标识，显微镜放大倍率和图片内容。将样品固定在手腕和脚踝上。在沿着正轴向尾部切割皮肤之前，用镊子提起颈部中间的皮肤，然后用剪刀将皮肤切向两个腋窝。
然后将皮肤从脐部切到腿部。嵌入样品后，将激光投影位置调整到屏幕上样品的中心，并将变焦旋钮调整为 20 倍。要优化分辨率，请将增益设置为1， 250V。
使用对焦旋钮最大化蓝色区域，然后将增益重置为约750V以进行成像。接下来，将切割方法切换为自动。将厚度设置为大约 50 微米并运行载玻片。
当肺部和气道在视野范围内时停止切割。选择8到10微米之间的切割厚度，并停止实时取景打开。打开切片机通讯器以开始成像。
在收集映像之前，请确保临时存储文件夹为空。当没有硬结构可见时停止图像集合。将临时存储的文件输出到一个 TIFF 图像系列中。
对于3D图像重建，将图像文件拖放到图像处理软件中。弹出窗口出现后，选择要复制到数据库中的链接或文件。打开文件后，单击工具栏中的 2D 3D 重建工具菜单，然后选择 3D MPR。
对于像素 X 分辨率和像素 Y 分辨率，通过给出 ECM 成像期间使用的缩放来输入图像分辨率。对于切片间隔，输入用于在ECM成像期间切割的切片厚度。接下来，使用 WWWL 工具调整窗口宽度和窗口级别。
向上单击并拖动图像上的工具可降低图像亮度，向下拖动可增加图像亮度。单击并向右拖动图像上的工具可降低图像对比度，向左拖动可增加图像对比度。使用平移工具将图像拖动到所需位置。
使用缩放工具放大或缩小图像，使用旋转工具根据需要旋转图像。现在，单击并拖动第一个面板的彩色轴。请注意旋转此轴如何更改其他两个面板的方向。
旋转三个面板轴，直到三个面板代表样品的冠状视图、矢状面和横向视图。将所有三个面板正确定位、定向和变亮后，单击代表日冕视图的面板。然后点击 电影导出 在菜单栏的右侧。
单击批处理并拖动“从”和“到”滑块以包含整个感兴趣区域。对于间隔，选择与厚度相同的选项并保存指示视图方向的视频。超声显示室间隔完整，无脑室内分流，正常对照组相关大动脉正常，ECM 证实。
正面视图显示 LA、RA、WV 和 RV 在回声和 ECM 中的通信，提示房室间隔缺损。颜色流动显示通过左心室和右心室的血流，提示室间隔缺损。超声和ECM显示右心室双出口，左心室和右心室之间室间隔缺损，并排大动脉。
持续性永存动脉干的超声诊断显示左心室和右心室之间的交通，单个流出道覆盖双心室，ECM 在 E14.5 阶段也证实了这一点。从 ECM 组织学收集的切片可以进一步处理用于免疫染色、苏木精和伊红染色，甚至可以进行核酸提取以进行基因分型和转录分析或蛋白质提取以进行蛋白质组学分析。来自三维重建的图像可以进一步处理，以评估定量周长，例如面积或体积。
准确的表型以识别心血管解剖结构中的缺陷对于建立先天性心脏病的基因工程和突变小鼠模型以阐明先天性心脏病的病理机制至关重要。这可以带来开发疗法和干预措施以改善先天性心脏病患者临床结果的潜在机会。
