פרוטוקול זה מתאר שיטות חדשניות להפקת נתוני הדמיה ברזולוציה גבוהה לאבחון מומי לב מולדים. אנו מבצעים הערכות תפקודיות עם אקוקרדיוגרפיה עוברית לא פולשנית בשילוב עם נקרופסיה, ולאחר מכן היסטופתולוגיה אפיסקופלית של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי ליצור ערימות תמונה דו-ממדיות סדרתיות ושחזורים תלת-ממדיים לאבחון CHD מקיף. שיטה זו יכולה להבהיר את השינויים האנטומיים המפורטים לא רק במחלות לב מולדות, אלא גם יכולה לשמש לחקר מומים מולדים מבניים באיברים אחרים, כולל מומים בפנים גולגולתיים, אנומליות בגפיים ובשלד, כמו גם פגמים במוח ובאיברים קרביים אחרים.
מי שידגימו את הנהלים האלה יהיו מייגן הולברוק, קרלה גוזמן, פייז'או ז'אנג ובנג'מין גלנון, כולם חוקרים מהמעבדה שלנו. לאחר הכנת העכבר להליך, חממו את ג'ל האולטרסאונד לטמפרטורת הגוף ומרחו אותו בנדיבות על אזור ההדמיה. לאחר מכן הניחו את המתמר על הבטן בכיוון מישור אופקי וזהו את שלפוחית השתן על המסך.
לאחר זיהוי שלפוחית השתן, סרקו גולגולת משלפוחית השתן, חפשו את העובר וקבעו את גיל ההריון על ידי מדידת הכתר לאורך העכוז. לאחר מכן, השתמש בדופלר הצבע כדי לנתח את זרימת הדם מהלב. כדי לאפשר חדירה מקובעת לאיברים הפנימיים, יש לבצע חתכים בבית החזה ובבטן הצידיים באמצעות מלקחיים או מספריים מנתחים ולאפשר לדגימה להתקבע לפחות 24 שעות בחדר קר.
לאחר מכן הגדר את התוכנה כדי לשמור את התמונות עם שם, כולל זיהוי הדגימה, הגדלת המיקרוסקופ ותוכן התמונה. הצמידו את הדגימה דרך פרקי הידיים והקרסוליים. לפני חיתוך העור לאורך הציר החציוני לכיוון הזנב, הרימו את העור באמצע הצוואר באמצעות מלקחיים וחתכו את העור לכיוון שני בתי השחי בעזרת המספריים.
ואז לחתוך את העור מן הטבור אל הרגליים. לאחר הטמעת הדגימות, התאם את מיקום הקרנת הלייזר למרכז הדגימה על המסך וכוונן את ידית הזום ל- 20x. כדי לייעל את הרזולוציה, הגדר את הרווח ל- 1, 250V.
הגדל את האזור הכחול באמצעות ידית המיקוד, ולאחר מכן אפס את הרווח לכ- 750 וולט לצורך הדמיה. לאחר מכן, החלף את שיטת החיתוך לאוטומטית. הגדר את העובי לסביבות 50 מיקרומטר והפעל את המגלשות.
הפסיקו לחתוך כאשר הריאות ודרכי הנשימה גלויות. בחר עובי חיתוך בין שמונה ל -10 מיקרומטר ועצור את התצוגה החיה פתוחה. פתח את Microtome Communicator כדי להתחיל בהדמיה.
ודא שתיקיית האחסון הזמני ריקה לפני איסוף תמונות. עצור את אוסף התמונות כאשר לא נראה מבנה קשיח. הפק פלט של הקבצים המאוחסנים הזמניים בסדרת תמונות TIFF אחת.
לשחזור תמונה תלת-ממדית, גרור ושחרר את קובצי התמונה לתוך תוכנת עיבוד התמונה. לאחר הופעת החלון המוקפץ, בחר את הקישורים או הקבצים שברצונך להעתיק למסד הנתונים. לאחר פתיחת הקובץ, לחץ על תפריט כלי שחזור תלת מימד 2D מסרגל הכלים ובחר 3D MPR.
לרזולוציית פיקסל X ורזולוציית פיקסל Y, הזן את רזולוציית התמונה על-ידי מתן הזום המשמש במהלך הדמיית ECM. עבור מרווח הזמן של הפרוסה, הזן את עובי הפרוסה המשמש לחיתוך במהלך הדמיית ECM. לאחר מכן, השתמש בכלי WWWL כדי להתאים את רוחב החלון ואת רמת החלון.
לחצו וגררו את הכלי בתמונה כלפי מעלה כדי להקטין את בהירות התמונה וכלפי מטה כדי להגדיל אותה. לחצו וגררו את הכלי בתמונה ימינה כדי להקטין את ניגודיות התמונה ואת המילה השמאלית כדי להגדיל אותה. גררו את התמונות למיקומים הרצויים בעזרת הכלי גלילה.
השתמשו בכלי זום להגדלה או כיווץ של התמונה ובכלי סיבוב כדי לסובב את התמונה כרצונכם. כעת, לחץ וגרור את הציר הצבעוני של החלונית הראשונה. שימו לב כיצד סיבוב ציר זה משנה את הכיוון של שתי החלוניות האחרות.
סובבו את שלושת צירי החלונית עד ששלושת הלוחות ייצגו את התצוגה העטרתית, הסגיטלית והרוחבית של הדגימה. לאחר שכל שלושת הלוחות ממוקמים, מכוונים ומובהרים כראוי, לחץ על החלונית המייצגת את תצוגת העטרה. לאחר מכן לחץ על ייצוא סרטים בצד ימין של שורת התפריטים.
לחץ על אצווה וגרור את המחוונים מ ואל כדי להקיף את כל אזור העניין. למרווחי זמן, בחר באפשרות זהה לעובי ושמור את הווידאו המציין את כיוון התצוגות. ההד מראה מחיצת חדר שלמה ללא שאנט תוך ורידי ועורקים גדולים קשורים נורמליים בבקרה הרגילה, שאושרה על ידי ECM.
התצוגה הקדמית מדגימה תקשורת בין LA, RA, LV ו- RV הן בהד והן ב- ECM, מה שמרמז על פגם מחיצה אטריובנטריקולרי. זרימת הצבע מדגימה את הזרימה על פני LV ו- RV המציינת פגם מחיצה חדרי. אקו ו-ECM הדגימו מוצא כפול של החדר הימני עם פגם מחיצה חדרי בין LV ל-RV עם עורקים גדולים זה לצד זה.
אבחון אולטרסאונד של truncus arteriosus מתמשך מדגים תקשורת בין LV ו- RV עם מערכת זרימה אחת העוקפת את שני החדרים, שאושרה גם על ידי ECM בשלב E14.5. החלקים שנאספו מהיסטולוגיה ECM יכולים להיות מעובדים עוד יותר עבור immunostaining, hematoxylin ו eosin צביעה ואפילו מיצוי חומצות גרעין עבור גנוטיפ פרופיל שעתוק או מיצוי חלבונים עבור ניתוח proteomic. התמונות משחזור תלת מימדי יכולות להיות מעובדות עוד יותר להערכות של היקפים כמותיים כגון שטח או נפח.
פנוטיפ מדויק לזיהוי פגמים באנטומיה הקרדיווסקולרית חיוני לביסוס מודלים עכבריים מהונדסים גנטית ומוטנטים של מחלות לב מולדות כדי להבהיר את הפתומנגנונים של מחלות לב מולדות. זה יכול להוביל להזדמנויות פוטנציאליות לפתח טיפולים והתערבות כדי לשפר את התוצאה הקלינית בחולים עם מחלת לב מולדת.
